コンピュータ断層撮影（CT）で確認された肺結節の鑑別診断は、臨床現場では依然として課題となっている。本研究では、健常対照群、良性肺結節、ステージI肺腺癌を含む480の血清サンプルの全体的なメタボロームを特徴づけた。腺癌は独自のメタボロームプロファイルを示す一方、良性結節と健常者はメタボロームプロファイルにおいて高い類似性を示した。探索群（n = 306）では、良性結節と悪性結節を鑑別するための27の代謝物セットが同定された。内部検証群（n = 104）と外部検証群（n = 111）における判別モデルのAUCは、それぞれ0.915と0.945であった。経路解析の結果、肺腺癌患者の血清では、良性結節および健常対照群と比較して、トリプトファンの減少に伴う解糖系代謝産物の増加が認められ、トリプトファンの取り込みが肺癌細胞における解糖を促進することが示唆された。本研究は、CT検査で検出される肺結節のリスク評価において、血清代謝物バイオマーカーが有用であることを示している。
がん患者の生存率を向上させるには、早期診断が不可欠です。米国国立肺がんスクリーニング試験（NLST）と欧州NELSON研究の結果から、低線量CT（LDCT）によるスクリーニングは、高リスク群における肺がん死亡率を大幅に減少させることができることが示されています1,2,3。肺がんスクリーニングにLDCTが広く使用されるようになって以来、無症状の肺結節の偶発的な放射線学的所見の発生率は増加し続けています4。肺結節は、直径3cmまでの局所的な陰影と定義されます5。LDCTで偶発的に検出された多数の肺結節の悪性の可能性を評価し、対処することは困難です。CTの限界により、頻繁なフォローアップ検査や偽陽性結果が生じ、不必要な介入や過剰治療につながる可能性があります6。したがって、肺がんを早期段階で正しく特定し、初期発見時にほとんどの良性結節を区別するための信頼性が高く有用なバイオマーカーを開発する必要がある7。
ゲノミクス、プロテオミクス、DNAメチル化8,9,10を含む血液（血清、血漿、末梢血単核細胞）の包括的な分子解析により、肺がんの診断バイオマーカーの発見への関心が高まっています。一方、メタボロミクスアプローチは、内因性および外因性の作用によって影響を受ける細胞最終産物を測定し、疾患の発症と転帰の予測に用いられています。液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（LC-MS）は、その高い感度と広いダイナミックレンジにより、さまざまな物理化学的特性を持つ代謝物を網羅できるため、メタボロミクス研究に広く用いられている方法です11,12,13。血漿/血清の包括的なメタボロミクス解析は、肺がんの診断14,15,16,17および治療効果18に関連するバイオマーカーの特定に用いられてきましたが、良性および悪性の肺結節を区別するための血清代謝物分類器については、まだ多くの研究が必要です。
腺癌と扁平上皮癌は、非小細胞肺癌（NSCLC）の2つの主要なサブタイプです。さまざまなCTスクリーニング検査では、腺癌が肺癌の最も一般的な組織型であることが示されています1,19,20,21。この研究では、超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を使用して、健康対照、良性肺結節、およびステージI肺腺癌のCT検出≤3cmを含む合計695の血清サンプルでメタボロミクス分析を実施しました。肺腺癌を良性結節および健康対照から区別する血清代謝物のパネルを特定しました。パスウェイエンリッチメント分析により、異常なトリプトファンおよびグルコース代謝が、良性結節および健康対照と比較して肺腺癌で共通の変化であることが明らかになりました。最後に、LDCTで検出された悪性肺結節と良性肺結節を区別するための、特異度と感度の高い血清代謝分類器を確立し、検証しました。これは、早期の鑑別診断とリスク評価に役立つ可能性があります。
本研究では、性別および年齢を一致させた血清サンプルを、健常対照者174名、良性肺結節患者292名、およびステージI肺腺癌患者229名から遡及的に収集した。対象者695名の人口統計学的特徴は補足表1に示す。
図 1a に示すように、合計 480 の血清サンプル (174 の健常対照 (HC)、170 の良性結節 (BN)、および 136 のステージ I 肺腺癌 (LA) サンプルを含む) が中山大学がんセンターで収集されました。超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法 (UPLC-HRMS) を使用した非標的メタボロミクスプロファイリングの発見コホート。補足図 1 に示すように、LA と HC、LA と BN の間の差次的代謝物が特定され、分類モデルが確立され、差次的経路分析がさらに検討されました。中山大学がんセンターで収集された 104 サンプルと他の 2 つの病院で収集された 111 サンプルが、それぞれ内部検証と外部検証にかけられました。
a 超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて血清メタボロミクス解析を実施した、発見コホートの研究対象集団。 b 健常対照群（HC、n = 174）、良性結節（BN、n = 170）、ステージI肺腺癌（ロサンゼルス、n = 136）を含む、研究コホートの480の血清サンプルの全メタボロームの部分最小二乗判別分析（PLS-DA）。+ESI、正のエレクトロスプレーイオン化モード、-ESI、負のエレクトロスプレーイオン化モード。 c～e 2つのグループで有意に異なる存在量を示す代謝物（両側ウィルコクソン符号順位検定、偽発見率調整済みp値、FDR <0.05）を、赤色（倍率変化 > 1.2）と青色（倍率変化 < 0.83）で示しています。 ）はボルケーノグラフに示されています。 f LAとBNの間で注釈付き代謝物の数に有意な差があることを示す階層的クラスタリングヒートマップ。ソースデータはソースデータファイルの形式で提供されます。
発見グループの174人のHC、170人のBN、136人のLAの血清メタボローム全体をUPLC-HRMS分析で分析した。まず、品質管理（QC）サンプルが教師なし主成分分析（PCA）モデルの中心に密にクラスター化していることを示し、本研究のパフォーマンスの安定性を確認した（補足図2）。
図1bに示す部分最小二乗判別分析（PLS-DA）では、LAとBN、LAとHCの間には、正（+ESI）および負（−ESI）のエレクトロスプレーイオン化モードで明確な違いが見られました。しかし、BNとHCの間には、+ESIと−ESIの条件下で有意な差は見られませんでした。
LAとHCの間で382の差異特徴、LAとBNの間で231の差異特徴、BNとHCの間で95の差異特徴が見つかりました（Wilcoxon符号順位検定、FDR <0.05、多重変化 >1.2または<0.83）（図1c-e）。ピークはさらに、m/z値、保持時間、フラグメンテーション質量スペクトル検索（詳細は方法の項に記載）によりデータベース（mzCloud/HMDB/Chemspiderライブラリ）に対して注釈付けされました（補足データ3）。最終的に、LA対BN（図1fおよび補足表2）とLA対HC（補足図3および補足表2）で、それぞれ33と38の注釈付き代謝物が、存在量に有意差があることが確認されました。対照的に、BNとHCで存在量に有意差のある代謝物は3つしか同定されず（補足表2）、これはPLS-DAにおけるBNとHCの重複と一致している。これらの差次的代謝物は、幅広い生化学物質を網羅している（補足図4）。これらの結果を総合すると、良性肺結節または健常者と比較して、早期肺癌の悪性形質転換を反映する血清メタボロームの有意な変化が実証される。一方、BNとHCの血清メタボロームの類似性は、良性肺結節が健常者と多くの生物学的特徴を共有している可能性を示唆している。上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子変異は肺腺癌サブタイプ23で一般的であることから、ドライバー変異が血清メタボロームに及ぼす影響を調べた。次に、肺腺癌群のEGFR状態を有する72症例の全体的なメタボロームプロファイルを分析した。興味深いことに、PCA分析ではEGFR変異患者（n = 41）とEGFR野生型患者（n = 31）の間で類似したプロファイルが見られました（補足図5a）。しかし、EGFR変異患者では野生型EGFR患者と比較して存在量が有意に変化した代謝物が7つ特定されました（t検定、p < 0.05、倍率変化 > 1.2または< 0.83）（補足図5b）。これらの代謝物の大部分（7つのうち5つ）はアシルカルニチンであり、脂肪酸酸化経路において重要な役割を果たしています。
図 2 a に示すワークフローで示されているように、結節分類のバイオマーカーは、LA (n = 136) と BN (n = 170) で同定された 33 の差次的代謝物に基づいて、最小絶対収縮演算子を使用して取得されました。変数の最適な組み合わせ (LASSO) – 二項ロジスティック回帰モデル。モデルの信頼性をテストするために、10 分割交差検証が使用されました。変数の選択とパラメータの正則化は、パラメータ λ24 の尤度最大化ペナルティによって調整されます。判別モデルの分類性能をテストするために、内部検証 (n = 104) および外部検証 (n = 111) グループでグローバルメタボロミクス分析がさらに独立して実行されました。その結果、発見セットの 27 の代謝物が、平均 AUC 値が最大の最適な判別モデルとして同定されました (図 2b)。そのうち 9 は LA で BN と比較して活性が増加し、18 は活性が減少しました (図 2c)。
肺結節分類器を構築するためのワークフロー。これには、10 分割交差検証による二項ロジスティック回帰モデルを使用して発見セットで最適な血清代謝物パネルを選択し、内部検証セットと外部検証セットで予測性能を評価することが含まれます。 b 代謝バイオマーカー選択のための LASSO 回帰モデルの交差検証統計。上記の数値は、特定の λ で選択されたバイオマーカーの平均数を表します。赤い点線は、対応するラムダでの平均 AUC 値を表します。灰色のエラー バーは、最小および最大の AUC 値を表します。点線は、選択された 27 個のバイオマーカーを使用した最適なモデルを示します。AUC は、受信者操作特性 (ROC) 曲線の下の面積です。 c 発見グループの BN グループと比較した LA グループでの 27 個の選択された代謝物の変化率。赤い列は活性化、青い列は減少です。 d～f 発見セット、内部検証セット、外部検証セットにおける27種類の代謝物組み合わせに基づく判別モデルの検出力を示す受信者操作特性（ROC）曲線。ソースデータはソースデータファイルの形式で提供されます。
これらの 27 の代謝物の加重回帰係数に基づいて予測モデルが作成されました (補足表 3)。これらの 27 の代謝物に基づく ROC 分析では、曲線下面積 (AUC) 値が 0.933、発見グループの感度が 0.868、特異度が 0.859 でした (図 2d)。一方、LA と HC の間の 38 の注釈付き差次的代謝物のうち、16 の代謝物のセットは、LA と HC を識別する際に、感度 0.801、特異度 0.856 で AUC 0.902 を達成しました (補足図 6a-c)。差次的代謝物の異なるフォールドチェンジ閾値に基づく AUC 値も比較されました。分類モデルは、フォールドチェンジレベルを1.5または2.0ではなく1.2に設定した場合に、LAとBN（HC）を識別するのに最も優れた性能を発揮することがわかりました（補足図7a、b）。27の代謝物グループに基づく分類モデルは、内部コホートと外部コホートでさらに検証されました。内部検証のAUCは0.915（感度0.867、特異度0.811）、外部検証のAUCは0.945（感度0.810、特異度0.979）でした（図2e、f）。ラボ間の効率を評価するために、外部コホートからの40サンプルを、方法のセクションで説明したように外部ラボで分析しました。分類精度はAUC 0.925を達成しました（補足図8）。肺扁平上皮癌（LUSC）は肺腺癌（LUAD）に次いで非小細胞肺癌（NSCLC）の2番目に多いサブタイプであるため、代謝プロファイルの検証済みの潜在的有用性もテストしました。BNと16例のLUSCを対象としました。LUSCとBNの判別のAUCは0.776（補足図9）であり、LUADとBNの判別と比較して能力が低いことを示しています。
研究によると、CT画像上の結節のサイズは悪性の可能性と正の相関があり、結節治療の主要な決定要因となっていることが示されています25,26,27。NELSONスクリーニング研究の大規模コホートのデータ分析では、5 mm未満の結節を有する被験者の悪性リスクは、結節のない被験者のリスクとほぼ同じであることが示されました28。したがって、定期的なCTモニタリングが必要な最小サイズは、英国胸部学会（BTS）が推奨する5 mm、およびフライシュナー学会が推奨する6 mmです29。しかし、6 mmより大きく、明らかな良性の特徴を持たない結節は、不確定肺結節（IPN）と呼ばれ、臨床診療における評価と管理において依然として大きな課題となっています30,31。次に、発見コホートと内部検証コホートのプールサンプルを使用して、結節サイズがメタボロミクスシグネチャに影響を与えるかどうかを調べました。検証済みの27のバイオマーカーに焦点を当て、まずHCとBNの6mm未満のメタボロームのPCAプロファイルを比較しました。HCとBNのデータポイントのほとんどが重なり合っており、両グループで血清代謝物レベルが類似していることが示されました（図3a）。異なるサイズ範囲にわたる特徴マップはBNとLAで保存されたままでしたが（図3b、c）、6～20mmの範囲では悪性結節と良性結節の分離が観察されました（図3d）。このコホートは、6～20mmの結節の悪性度を予測するためのAUCが0.927、特異度が0.868、感度が0.820でした（図3e、f）。私たちの結果は、分類器が結節のサイズに関係なく、初期の悪性化によって引き起こされる代謝変化を捉えることができることを示しています。
a 27 種類の代謝物の代謝分類器に基づく、指定されたグループ間の PCA プロファイルの比較。CC と BN < 6 mm。b BN < 6 mm と BN 6–20 mm。LA 6–20 mm と LA 20–30 mm の比較。g BN 6–20 mm と LA 6–20 mm。GC、n = 174; BN < 6 mm、n = 153; BN 6–20 mm、n = 91; LA 6–20 mm、n = 89; LA 20–30 mm、n = 77。e 6–20 mm の結節に対する判別モデルのパフォーマンスを示す受信者操作特性 (ROC) 曲線。f 6–20 mm の結節に対するロジスティック回帰モデルに基づいて確率値が計算されました。灰色の点線は最適なカットオフ値 (0.455) を表します。上記の数値は、ロサンゼルスで予測される症例数の割合を示しています。両側t検定を使用してください。PCAは主成分分析、AUCは曲線下面積です。ソースデータはソースデータファイルの形式で提供されます。
提案された悪性予測モデルの性能を示すために、同様の肺結節サイズ（7～9 mm）を持つ4つのサンプル（44～61歳）がさらに選択された（図4a、b）。最初のスクリーニングでは、ケース1は良性に関連する特徴である石灰化を伴う充実性結節として現れたが、ケース2は明らかな良性の特徴のない不確定な部分充実性結節として現れた。3回のフォローアップCTスキャンにより、これらの症例は4年間安定しており、良性結節とみなされた（図4a）。連続CTスキャンの臨床評価と比較して、現在の分類モデルを使用した単回血清代謝物分析は、確率的制約に基づいてこれらの良性結節を迅速かつ正確に識別した（表1）。ケース3の図4bは、悪性腫瘍と最もよく関連する胸膜収縮の兆候を伴う結節を示している32。症例4は、良性の原因を示す証拠のない、不確定な部分固形結節として現れた。これらの症例はすべて、分類モデルに従って悪性と予測された（表1）。肺切除手術後の組織病理学的検査により、肺腺癌の評価が実証された（図4b）。外部検証セットでは、代謝分類器は、6 mmを超える不確定な肺結節の2症例を正確に予測した（補足図10）。
良性結節の2症例の肺の軸位ウィンドウのCT画像。症例1では、4年後のCTスキャンで、右下葉に石灰化を伴う7mmの安定した充実性結節が認められた。症例2では、5年後のCTスキャンで、右上葉に直径7mmの安定した部分的に充実性の結節が認められた。b 肺切除前のステージI腺癌2症例の肺の軸位ウィンドウCT画像と対応する病理学的研究。症例3では、胸膜陥凹を伴う右上葉に直径8mmの結節が認められた。症例4では、左上葉に9mmの部分的に充実性のすりガラス状結節が認められた。切除した肺組織のヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色（スケールバー＝50μm）は、肺腺癌の腺房増殖パターンを示している。矢印はCT画像で検出された結節を示す。 H&E染色画像は、病理医が検査した複数の（3つ以上の）顕微鏡視野の代表的な画像である。
総合すると、我々の結果は、CTスクリーニングの評価において課題となる可能性のある肺結節の鑑別診断において、血清代謝物バイオマーカーが潜在的に有用であることを示している。
検証済みの差分代謝物パネルに基づいて、主要な代謝変化の生物学的相関関係を特定しようと試みました。MetaboAnalyst による KEGG パスウェイ濃縮分析により、2 つのグループ (LA vs. HC および LA vs. BN、調整済み p ≤ 0.001、効果 > 0.01) 間で 6 つの共通して有意に変化したパスウェイが特定されました。これらの変化は、ピルビン酸代謝、トリプトファン代謝、ナイアシンおよびニコチンアミド代謝、解糖、TCA サイクル、およびプリン代謝の障害によって特徴付けられました (図 5a)。次に、絶対定量を使用して主要な変化を確認するために、ターゲット メタボロミクスをさらに実行しました。真正代謝物標準を使用して、トリプル四重極質量分析法 (QQQ) により、共通して変化したパスウェイの共通代謝物を決定しました。メタボロミクス研究の対象サンプルの人口統計学的特徴は、補足表4に示されています。グローバルメタボロミクスの結果と一致して、定量分析により、ヒポキサンチン、キサンチン、ピルビン酸、乳酸が、BNおよびHCと比較してLAで増加していることが確認されました（図5b、c、p <0.05）。ただし、BNとHCの間では、これらの代謝物に有意な差は見られませんでした。
LA群とBN群およびHC群を比較した有意に異なる代謝物のKEGGパスウェイエンリッチメント解析。両側グローバルテストを使用し、p値はHolm-Bonferroni法で調整した（調整済みp ≤ 0.001、効果量 > 0.01）。b～d LC-MS/MSで測定した血清HC、BN、LAのヒポキサンチン、キサンチン、乳酸、ピルビン酸、トリプトファンのレベルを示すバイオリンプロット（各群n = 70）。白と黒の点線はそれぞれ中央値と四分位数を示す。e LUAD-TCGAデータセットの肺腺癌（n = 513）と正常肺組織（n = 59）におけるSLC7A5とQPRTの正規化Log2TPM（100万あたりの転写産物）mRNA発現を示すバイオリンプロット。白いボックスは四分位範囲を表し、中央の水平な黒線は中央値を表し、ボックスから伸びる垂直な黒線は 95% 信頼区間 (CI) を表します。 f TCGA データセットの肺腺癌 (n = 513) と正常肺組織 (n = 59) における SLC7A5 と GAPDH 発現のピアソン相関プロット。灰色の領域は 95% CI を表します。r、ピアソン相関係数。 g LC-MS/MS で測定した、非特異的 shRNA コントロール (NC) および shSLC7A5 (Sh1、Sh2) をトランスフェクトした A549 細胞の正規化された細胞内トリプトファンレベル。各グループの 5 つの生物学的に独立したサンプルの統計分析を示します。 h A549 細胞 (NC) および SLC7A5 ノックダウン A549 細胞 (Sh1、Sh2) の NADt (NAD+ および NADH を含む総 NAD) の細胞内レベル。各グループの生物学的に独立したサンプル3つについて統計分析を行った。i SLC7A5ノックダウン前後のA549細胞の解糖活性を細胞外酸性化速度（ECAR）で測定した（グループごとに生物学的に独立したサンプル4つ）。2-DGは2-デオキシ-D-グルコース。（b～h）では両側スチューデントt検定を用いた。（g～i）では、エラーバーは平均±SDを表し、各実験は独立して3回実施し、結果は同様であった。ソースデータはソースデータファイルの形式で提供した。
LA群におけるトリプトファン代謝の変化が大きな影響を及ぼしていることを考慮し、QQQを用いてHC、BN、LA群の血清トリプトファン濃度も評価した。その結果、血清トリプトファン濃度はHCまたはBNと比較してLAで低下していることがわかった（p < 0.001、図5d）。これは、循環トリプトファン濃度が肺がん患者では対照群の健常者よりも低いという以前の知見と一致する33,34,35。PET/CTトレーサー11C-メチル-L-トリプトファンを用いた別の研究では、肺がん組織におけるトリプトファンシグナル保持時間は良性病変または正常組織と比較して有意に増加していることがわかった36。LA血清中のトリプトファンの減少は、肺がん細胞によるトリプトファンの積極的な取り込みを反映している可能性があると我々は仮説を立てた。
トリプトファン異化のキヌレニン経路の最終産物はNAD+37,38であり、これは解糖系におけるグリセルアルデヒド-3-リン酸と1,3-ビスホスホグリセリン酸の反応の重要な基質であることが知られている39。これまでの研究では免疫調節におけるトリプトファン異化の役割に焦点が当てられてきたが、本研究ではトリプトファン調節異常と解糖経路の相互作用を解明しようとした。溶質トランスポーターファミリー7メンバー5（SLC7A5）はトリプトファントランスポーターであることが知られている43,44,45。キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（QPRT）はキヌレニン経路の下流に位置する酵素で、キノリン酸をNAMNに変換する46。LUAD TCGAデータセットを調べたところ、SLC7A5とQPRTの両方が正常組織と比較して腫瘍組織で有意に上方制御されていることが明らかになった（図5e）。この増加は肺腺癌のステージIおよびIIだけでなく、ステージIIIおよびIVでも観察され（補足図11）、腫瘍形成に関連するトリプトファン代謝の早期障害を示している。
さらに、LUAD-TCGAデータセットでは、癌患者サンプルにおけるSLC7A5とGAPDH mRNA発現の間に正の相関が認められました（r = 0.45、p = 1.55E-26、図5f）。対照的に、正常肺組織ではこのような遺伝子シグネチャー間に有意な相関は認められませんでした（r = 0.25、p = 0.06、図5f）。A549細胞におけるSLC7A5のノックダウン（補足図12）は、細胞内トリプトファンおよびNAD(H)レベルを著しく低下させ（図5g、h）、細胞外酸性化速度（ECAR）で測定した解糖活性の低下をもたらしました（図1）。5i）。したがって、血清およびin vitroでの検出における代謝変化に基づき、トリプトファン代謝はキヌレニン経路を介してNAD+を生成し、肺癌における解糖を促進する上で重要な役割を果たしている可能性があると仮説を立てました。
研究では、LDCTで検出された多数の不確定な肺結節が、PET-CT、肺生検などの追加検査の必要性や、悪性腫瘍の偽陽性診断による過剰治療につながる可能性があることが示されています。31 図6に示すように、私たちの研究では、CTで検出された肺結節のリスク層別化とその後の管理を改善する可能性のある診断的価値を持つ血清代謝物のパネルを特定しました。
肺結節は、良性または悪性の原因を示唆する画像所見を伴う低線量コンピュータ断層撮影（LDCT）を用いて評価されます。結節の予後が不確実であるため、頻繁なフォローアップ受診、不必要な介入、過剰治療につながる可能性があります。診断的価値のある血清代謝分類因子を含めることで、リスク評価とそれに続く肺結節の管理が改善される可能性があります。PETは陽電子放出断層撮影です。
米国のNLST研究と欧州のNELSON研究のデータによると、低線量CT（LDCT）による高リスク群のスクリーニングは肺がん死亡率を低下させる可能性がある1,3。しかし、LDCTで偶然発見された多数の肺結節のリスク評価とそれに続く臨床管理は依然として最も困難な課題である。主な目標は、信頼性の高いバイオマーカーを組み込むことで、既存のLDCTベースのプロトコルの正しい分類を最適化することである。
肺がんと健常対照群を比較することで、血液代謝物などの特定の分子バイオマーカーが特定されている15,17。本研究では、LDCTで偶然発見された良性肺結節と悪性肺結節を区別するために、血清メタボロミクス分析の応用に着目した。健常対照群（HC）、良性肺結節（BN）、ステージI肺腺癌（LA）のサンプルの血清メタボローム全体をUPLC-HRMS分析で比較した。HCとBNは類似した代謝プロファイルを示したが、LAはHCとBNと比較して有意な変化を示した。LAをHCとBNから区別する2組の血清代謝物を特定した。
良性および悪性結節の現在のLDCTに基づく識別スキームは、主に結節のサイズ、密度、形態、および時間の経過に伴う成長率に基づいています30。これまでの研究では、結節のサイズは肺がんの可能性と密接に関連していることが示されています。高リスク患者であっても、6 mm未満の結節の悪性リスクは1%未満です。6～20 mmの結節の悪性リスクは8%から64%の範囲です30。したがって、Fleischner Societyは、ルーチンCTフォローアップのカットオフ径を6 mmとすることを推奨しています29。しかし、6 mmを超える不確定肺結節（IPN）のリスク評価と管理は十分に行われていません31。先天性心疾患の現在の管理は通常、頻繁なCTモニタリングによる経過観察に基づいています。
検証済みのメタボロームに基づいて、健康な人と 6 mm 未満の良性結節の間でメタボローム シグネチャが重複していることを初めて実証しました。生物学的類似性は、6 mm 未満の結節の悪性リスクは結節のない被験者と同じくらい低いという以前の CT 所見と一致しています。30 また、私たちの結果は、6 mm 未満の良性結節と 6 mm 以上の良性結節のメタボローム プロファイルが高い類似性を持っていることも示しており、良性病因の機能的定義は結節のサイズに関係なく一貫していることを示唆しています。したがって、最新の診断用血清代謝物パネルは、CT で最初に結節が検出されたときに除外検査として単一のアッセイを提供し、連続モニタリングを減らす可能性があります。同時に、同じ代謝バイオマーカーのパネルは、6 mm 以上のサイズの悪性結節を良性結節から区別し、CT 画像で同様のサイズと曖昧な形態学的特徴を持つ IPN の正確な予測を提供しました。この血清代謝分類器は、6mm以上の結節の悪性度予測において、AUC値0.927という優れた性能を示した。これらの結果を総合すると、独自の血清メタボロームシグネチャは、腫瘍誘発性の初期代謝変化を特異的に反映し、結節の大きさに関わらず、リスク予測因子として潜在的な価値を持つ可能性があることが示唆される。
特に、肺腺癌（LUAD）と扁平上皮癌（LUSC）は、非小細胞肺癌（NSCLC）の主な種類です。LUSCは喫煙と強く関連しており47、LUADはCTスクリーニングで偶然発見される肺結節の最も一般的な組織型であること48から、私たちの分類モデルはステージIの腺癌サンプル用に特別に構築されました。WangらはLUADにも注目し、脂質オミクスを使用して9つの脂質シグネチャを特定し、早期の肺癌と健康な人を区別しました17。私たちは現在の分類モデルをステージIのLUSC 16例と良性結節74例でテストし、LUSCの予測精度が低い（AUC 0.776）ことを観察しました。これは、LUADとLUSCが独自のメタボロミクスシグネチャを持っている可能性があることを示唆しています。実際、LUADとLUSCは、病因、生物学的起源、遺伝子異常が異なることが示されています49。したがって、スクリーニングプログラムにおける集団ベースの肺がん検出のためのトレーニングモデルには、他の組織学的分類も含めるべきである。
ここでは、肺腺癌と健常対照群および良性結節との比較において、最も頻繁に変化した6つの経路を特定しました。キサンチンとヒポキサンチンは、プリン代謝経路の一般的な代謝産物です。我々の結果と一致して、プリン代謝に関連する中間体は、肺腺癌患者の血清または組織において、健常対照群または前浸潤期の患者と比較して有意に増加していました15,50。血清中のキサンチンおよびヒポキサンチン濃度の上昇は、急速に増殖する癌細胞に必要な同化作用を反映している可能性があります。グルコース代謝の調節異常は、癌代謝のよく知られた特徴です51。ここでは、LA群においてHC群およびBN群と比較してピルビン酸および乳酸が有意に増加していることが観察されました。これは、非小細胞肺癌（NSCLC）患者および健常対照群の血清メタボロームプロファイルにおける解糖経路異常に関する以前の報告と一致しています。結果は一致しています52,53。
重要なことに、肺腺癌の血清中のピルビン酸とトリプトファン代謝の間に逆相関が観察されました。LA群では、HC群またはBN群と比較して血清トリプトファン濃度が低下していました。興味深いことに、前向きコホートを用いた以前の大規模研究では、循環トリプトファン濃度が低いと肺癌のリスクが増加することが判明しました54。トリプトファンは必須アミノ酸であり、食物からのみ摂取されます。肺腺癌における血清トリプトファンの枯渇は、この代謝物の急速な枯渇を反映している可能性があると結論付けます。キヌレニン経路を介したトリプトファン異化の最終産物が、de novo NAD+合成の源であることはよく知られています。NAD+は主にサルベージ経路を介して生成されるため、健康および疾患におけるトリプトファン代謝におけるNAD+の重要性はまだ解明されていません46。 TCGAデータベースの解析により、トリプトファン輸送体溶質輸送体7A5（SLC7A5）の発現が正常対照群と比較して肺腺癌で有意に増加し、解糖酵素GAPDHの発現と正の相関があることが示されました。これまでの研究は主に、抗腫瘍免疫応答の抑制におけるトリプトファン異化の役割に焦点を当ててきました40,41,42。本研究では、肺癌細胞におけるSLC7A5のノックダウンによるトリプトファン取り込みの阻害が、細胞内NADレベルの低下とそれに伴う解糖活性の減弱をもたらすことを明らかにしました。要約すると、本研究は、肺腺癌の悪性形質転換に伴う血清代謝の変化の生物学的基盤を提供します。
EGFR変異は、NSCLC患者で最も一般的なドライバー変異です。私たちの研究では、EGFR変異を有する患者（n = 41）は、野生型EGFRを有する患者（n = 31）と全体的なメタボロームプロファイルが類似していることがわかりましたが、一部のEGFR変異患者ではアシルカルニチンの血清レベルが低下していることがわかりました。アシルカルニチンの確立された機能は、アシル基を細胞質からミトコンドリアマトリックスに輸送し、脂肪酸の酸化によってエネルギーを生成することです55。私たちの発見と一致して、最近の研究でも、102個の肺腺癌組織サンプルの全体的なメタボロームを分析することにより、EGFR変異腫瘍とEGFR野生型腫瘍の間で同様のメタボロームプロファイルが特定されました50。興味深いことに、アシルカルニチン含有量はEGFR変異群でも見つかりました。したがって、アシルカルニチン濃度の変化がEGFR誘導性の代謝変化およびその根底にある分子経路を反映しているかどうかについては、さらなる研究が必要であると考えられる。
結論として、本研究は肺結節の鑑別診断のための血清代謝分類器を確立し、CTスキャンスクリーニングに基づいてリスク評価を最適化し、臨床管理を容易にするワークフローを提案するものである。
この研究は、中山大学がん病院倫理委員会、中山大学第一附属病院倫理委員会、および鄭州大学がん病院倫理委員会の承認を得ています。発見グループと内部検証グループでは、中山大学がんセンターがん予防管理科で年次健康診断を受けている健常者から174の血清、良性結節から244の血清が収集され、中山大学がんセンターから166の良性結節の血清が収集されました。ステージI肺腺癌は、外部検証コホートで、中山大学第一附属病院から48例の良性結節、39例のステージI肺腺癌、および鄭州がん病院から24例のステージI肺腺癌が収集されました。中山大学がんセンターは、確立された代謝分類器の診断能力をテストするために、ステージIの扁平上皮肺がんの症例16例も収集しました（患者特性は補足表5に示されています）。発見コホートと内部検証コホートのサンプルは、2018年1月から2020年5月の間に収集されました。外部検証コホートのサンプルは、2021年8月から2022年10月の間に収集されました。性別バイアスを最小限に抑えるため、各コホートには男性と女性の症例がほぼ同数割り当てられました。発見チームと内部レビューチーム。参加者の性別は自己申告に基づいて決定されました。すべての参加者からインフォームドコンセントが得られ、報酬は提供されませんでした。良性結節の被験者は、分析時に2～5年でCTスキャンスコアが安定していた被験者であり、術前に収集され組織病理学的に診断された外部検証サンプルの1例を除きます。慢性気管支炎を除きます。肺腺癌症例は肺切除前に収集され、病理診断によって確認された。空腹時の血液サンプルは抗凝固剤を含まない血清分離チューブに採取された。血液サンプルは室温で1時間凝固させ、その後4℃で2851×gで10分間遠心分離して血清上清を回収した。血清アリコートは代謝物抽出まで-80℃で凍結した。中山大学がんセンターがん予防医学検査部は、40歳から55歳までの男女同数を含む100人の健康なドナーから血清プールを収集した。各ドナーサンプルの等量を混合し、得られたプールをアリコートして-80℃で保存した。血清混合物は品質管理とデータ標準化の参照物質として使用した。
参照血清と試験サンプルを解凍し、複合抽出法（MTBE/メタノール/水）56を使用して代謝物を抽出した。簡単に説明すると、50 μlの血清を225 μlの氷冷メタノールと750 μlの氷冷メチルtert-ブチルエーテル（MTBE）と混合した。混合物をかき混ぜ、氷上で1時間インキュベートした。次に、サンプルを混合し、内部標準（13C-乳酸、13C3-ピルビン酸、13C-メチオニン、および13C6-イソロイシン、Cambridge Isotope Laboratoriesから購入）を含む188 μlのMSグレード水とボルテックス混合した。次に、混合物を4 °Cで15,000 × gで10分間遠心分離し、下層を2本のチューブ（各125 μL）に移し、正および負モードでLC-MS分析を行った。最後に、試料を高速真空濃縮器で完全に乾燥させた。
乾燥させた代謝物を 120 μl の 80% アセトニトリルに再溶解し、5 分間ボルテックスした後、4 °C で 15,000 × g で 10 分間遠心分離した。上清をメタボロミクス研究用のマイクロインサート付き琥珀色のガラスバイアルに移した。超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析 (UPLC-HRMS) プラットフォームでの非標的メタボロミクス分析。代謝物は、Dionex Ultimate 3000 UPLC システムと ACQUITY BEH Amide カラム (2.1 × 100 mm、1.7 μm、Waters) を使用して分離した。正イオンモードでは、移動相は 95% (A) と 50% アセトニトリル (B) で、それぞれ 10 mmol/L 酢酸アンモニウムと 0.1% ギ酸を含んでいた。ネガティブモードでは、移動相AとBはそれぞれ95%と50%のアセトニトリルを含み、両相とも10 mmol/Lの酢酸アンモニウムを含み、pHは9でした。グラジエントプログラムは次のとおりです。0～0.5分、2% B; 0.5～12分、2～50% B; 12～14分、50～98% B; 14～16分、98% B; 16～16.1分、98～2% B; 16.1～20分、2% B。カラムは40℃に、オートサンプラー内のサンプルは10℃に維持されました。流速は0.3 ml/分、注入量は3 μlでした。エレクトロスプレーイオン化（ESI）源を備えたQ-Exactive Orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific社製）をフルスキャンモードで動作させ、ddMS2モニタリングモードと組み合わせて大量のデータを収集した。MSパラメータは、スプレー電圧+3.8 kV/- 3.2 kV、キャピラリー温度320℃、シールドガス40 arb、補助ガス10 arb、プローブヒーター温度350℃、スキャン範囲70～1050 m/h、分解能70,000に設定した。データはXcalibur 4.1（Thermo Fisher Scientific社製）を使用して取得した。
データ品質を評価するために、各サンプルから上清の 10 μL アリコートを取り出してプールされた品質管理 (QC) サンプルを作成しました。UPLC-MS システムの安定性を評価するために、分析シーケンスの開始時に 6 つの品質管理サンプル注入を分析しました。その後、品質管理サンプルが定期的にバッチに導入されます。この研究の 11 バッチの血清サンプルはすべて LC-MS で分析されました。抽出プロセスを監視し、バッチ間の影響を調整するために、100 人の健康なドナーからの血清プール混合物のアリコートが各バッチの参照物質として使用されました。発見コホート、内部検証コホート、および外部検証コホートの非標的メタボロミクス分析は、中山大学メタボロミクスセンターで実施されました。広東工業大学分析試験センターの外部ラボも、分類器モデルの性能をテストするために、外部コホートから 40 サンプルを分析しました。
抽出および再構成後、血清代謝物の絶対定量は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）源を備えた超高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（Agilent 6495 トリプル四重極）を用いて多重反応モニタリング（MRM）モードで測定した。代謝物の分離には、ACQUITY BEH Amide カラム（2.1 × 100 mm、1.7 μm、Waters）を使用した。移動相は、90%（A）および5%アセトニトリル（B）に10 mmol/L酢酸アンモニウムおよび0.1%アンモニア溶液を加えたものから構成された。グラジエントプログラムは以下のとおりである：0～1.5分、0% B；1.5～6.5分、0～15% B；6.5～8分、15% B；8～8.5分、15%～0% B；8.5～11.5分、0% B。カラムは40℃、オートサンプラー内のサンプルは10℃に維持した。流量は0.3 mL/分、注入量は1 μLであった。MSパラメータは、キャピラリー電圧±3.5 kV、ネブライザー圧力35 psi、シースガス流量12 L/分、シースガス温度350℃、乾燥ガス温度250℃、乾燥ガス流量14 L/分に設定した。トリプトファン、ピルビン酸、乳酸、ヒポキサンチン、キサンチンのMRM変換値は、それぞれ205.0–187.9、87.0–43.4、89.0–43.3、135.0–92.3、151.0–107.9であった。データはMass Hunter B.07.00（Agilent Technologies）を使用して収集した。血清サンプルについては、標準混合溶液の検量線を用いて、トリプトファン、ピルビン酸、乳酸、ヒポキサンチン、およびキサンチンを定量した。細胞サンプルについては、トリプトファン含有量を内部標準および細胞タンパク質質量で正規化した。
ピーク抽出（m/z および保持時間（RT））は、Compound Discovery 3.1 および TraceFinder 4.0（Thermo Fisher Scientific）を使用して実行されました。バッチ間の潜在的な差異を排除するために、試験サンプルの各特徴的なピークを同じバッチの参照物質の特徴的なピークで除算して、相対存在量を取得しました。標準化の前後の内部標準の相対標準偏差は、補足表 6 に示されています。2 つのグループ間の違いは、偽発見率（FDR<0.05、Wilcoxon 符号順位検定）および倍率変化（>1.2 または <0.83）によって特徴付けられました。抽出された特徴の生 MS データと参照血清補正 MS データは、それぞれ補足データ 1 および補足データ 2 に示されています。ピーク注釈は、同定された代謝物、推定注釈化合物、推定特徴付けられた化合物クラス、および未知の化合物 22 を含む、定義された 4 つのレベルの同定に基づいて実行されました。 Compound Discovery 3.1 (mzCloud、HMDB、Chemspider) のデータベース検索に基づいて、MS/MS が検証済み標準に一致するか、mzCloud (スコア > 85) または Chemspider で完全一致の注釈を持つ生物学的化合物が、差分メタボロームの中間体として最終的に選択されました。各特徴のピーク注釈は補足データ 3 に含まれています。MetaboAnalyst 5.0 は、合計正規化された代謝物存在量の単変量解析に使用されました。MetaboAnalyst 5.0 は、有意に異なる代謝物に基づいて KEGG パスウェイ濃縮分析も評価しました。主成分分析 (PCA) および部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) は、スタック正規化と自動スケーリングを備えた ropls ソフトウェア パッケージ (v.1.26.4) を使用して分析されました。結節悪性度を予測するための最適な代謝物バイオマーカー モデルは、最小絶対収縮選択演算子 (LASSO、R パッケージ v.4.1-3) を使用した二項ロジスティック回帰を使用して生成されました。検出セットおよび検証セットにおける判別モデルの性能は、pROCパッケージ（v.1.18.0）によるROC分析に基づいてAUCを推定することで評価した。最適な確率カットオフ値は、モデルの最大Youden指数（感度＋特異度－1）に基づいて決定した。閾値より小さい値または大きい値を持つサンプルは、それぞれ良性結節および肺腺癌と予測される。
A549細胞（#CCL-185、American Type Culture Collection）を10% FBSを含むF-12K培地で培養した。SLC7A5を標的とする短鎖ヘアピンRNA（shRNA）配列と非標的コントロール（NC）をレンチウイルスベクターpLKO.1-puroに挿入した。shSLC7A5のアンチセンス配列は以下のとおりである：Sh1（5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′）、Sh2（5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′）。SLC7A5（#5347）およびチューブリン（#2148）に対する抗体はCell Signaling Technologyから購入した。SLC7A5およびチューブリンに対する抗体は、ウェスタンブロット解析に1:1000の希釈率で使用した。
Seahorse XFグリコーリシスストレス試験は、細胞外酸性化（ECAR）レベルを測定する試験です。この試験では、グルコース、オリゴマイシンA、および2-デオキシグルコースを順次投与し、ECARによって測定される細胞のグリコーリシス能力をテストします。
非標的コントロール（NC）およびshSLC7A5（Sh1、Sh2）をトランスフェクションしたA549細胞を直径10cmのディッシュに一晩播種した。細胞代謝物を氷冷した80%メタノール水溶液1mlで抽出した。メタノール溶液中の細胞を掻き取り、新しいチューブに集め、4℃で15分間15,000×gで遠心分離した。上清800µlを回収し、高速真空濃縮器を使用して乾燥させた。乾燥させた代謝物ペレットを、上記のようにLC-MS/MSを使用してトリプトファン濃度について分析した。A549細胞（NCおよびshSLC7A5）の細胞内NAD(H)濃度は、メーカーの指示に従って定量NAD+/NADH比色キット（#K337、BioVision）を使用して測定した。各サンプルのタンパク質濃度を測定し、代謝物の量を正規化した。
サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用しませんでした。バイオマーカー発見を目的とした過去のメタボロミクス研究15,18がサイズ決定のベンチマークとして考慮され、これらの報告と比較すると、私たちのサンプルは適切でした。研究コホートから除外されたサンプルはありませんでした。血清サンプルは、非標的メタボロミクス研究のために、発見グループ（306例、74.6%）と内部検証グループ（104例、25.4%）にランダムに割り当てられました。また、標的メタボロミクス研究のために、発見セットから各グループから70例をランダムに選択しました。研究者は、LC-MSデータの収集と分析の間、グループ割り当てを知らされていませんでした。メタボロミクスデータと細胞実験の統計分析は、それぞれの結果、図の説明、および方法のセクションで説明されています。細胞トリプトファン、NADT、および解糖活性の定量は、同じ結果で3回独立して実施されました。
研究デザインの詳細については、この記事に関連付けられているナチュラルポートフォリオレポートの要約を参照してください。
抽出された特徴の生MSデータと参照血清の正規化MSデータは、それぞれ補足データ1と補足データ2に示されています。差分特徴のピーク注釈は補足データ3に示されています。LUAD TCGAデータセットは、https://portal.gdc.cancer.gov/ からダウンロードできます。グラフ作成用の入力データはソースデータに含まれています。ソースデータはこの記事に提供されています。
National Lung Screening Study Group 他。低線量CTによる肺がん死亡率の低減。北イングランド。J. Med. 365, 395–409 (2011)。
Kramer, BS、Berg, KD、Aberle, DR、Prophet, PC「低線量ヘリカルCTを用いた肺がんスクリーニング：米国国立肺がんスクリーニング研究（NLST）の結果」J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. ランダム化試験における体積CTスクリーニングによる肺がん死亡率の低減。Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
投稿日時：2023年9月18日