コンピュータ断層撮影 (CT) によって特定される肺結節の鑑別診断は、臨床現場において依然として課題です。ここでは、健康な対照、良性肺結節、ステージ I の肺腺癌を含む 480 の血清サンプルの全体的なメタボロームを特徴付けます。腺癌は独特のメタボロームプロファイルを示しますが、良性結節と健康な個人はメタボロームプロファイルに高い類似性を持っています。発見グループ (n = 306) では、良性結節と悪性結節を区別するために 27 個の代謝産物のセットが同定されました。内部検証 (n = 104) グループと外部検証 (n = 111) グループの判別モデルの AUC は、それぞれ 0.915 と 0.945 でした。経路解析により、良性結節および健康な対照と比較して肺腺癌血清中のトリプトファンの減少に関連する解糖代謝物の増加が明らかになり、トリプトファンの取り込みが肺癌細胞の解糖を促進することが示唆されました。私たちの研究は、CTで検出される肺結節のリスクを評価する際の血清代謝産物バイオマーカーの価値を強調しています。
がん患者の生存率を向上させるには、早期診断が重要です。米国全国肺がんスクリーニング試験（NLST）と欧州のNELSON研究の結果は、低線量コンピュータ断層撮影（LDCT）によるスクリーニングが高リスク群の肺がん死亡率を大幅に低下させることができることを示しています1、2、3。肺がんスクリーニングに LDCT が広く使用されて以来、無症候性肺結節の偶発的な X 線検査所見の発生率は増加し続けています 4 。肺結節は、直径 3 cm までの限局性混濁として定義されます 5 。私たちは、悪性腫瘍の可能性を評価し、LDCT で偶然検出された多数の肺結節に対処するという困難に直面しています。CT の限界により、頻繁な追跡検査や偽陽性結果が発生し、不必要な介入や過剰治療につながる可能性があります6。したがって、初期段階で肺癌を正確に特定し、最初の検出時にほとんどの良性結節を区別するための信頼性が高く有用なバイオマーカーを開発する必要がある 7 。
ゲノミクス、プロテオミクス、または DNA メチル化などの血液 (血清、血漿、末梢血単核球) の包括的な分子解析 8、9、10 により、肺がんの診断用バイオマーカーの発見に対する関心が高まっています。一方、メタボロミクスアプローチは、内因性および外因性の作用によって影響を受ける細胞の最終産物を測定するため、疾患の発症と転帰を予測するために適用されます。液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS) は、感度が高く、ダイナミック レンジが広いため、さまざまな物理化学的特性を持つ代謝物をカバーできるため、メタボロミクス研究に広く使用されている方法です 11、12、13。血漿/血清の包括的なメタボローム解析は、肺がんの診断 14、15、16、17 と治療効果に関連するバイオマーカーを同定するために使用されてきましたが、肺結節の良性と悪性を区別するための血清代謝物分類子 18 については、まだ十分に研究されていません。-大規模な研究。
腺癌と扁平上皮癌は、非小細胞肺癌 (NSCLC) の 2 つの主要なサブタイプです。さまざまな CT スクリーニング検査により、腺癌が肺癌の最も一般的な組織型であることが示されています 1,19,20,21。この研究では、超高速液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法 (UPLC-HRMS) を使用して、健康な対照、良性肺結節、CT で検出された 3 cm 以下を含む合計 695 個の血清サンプルに対してメタボロミクス分析を実行しました。ステージ I の肺腺癌のスクリーニング。我々は、肺腺癌を良性結節および健康な対照から区別する血清代謝産物のパネルを特定した。パスウェイエンリッチメント分析により、異常なトリプトファンおよびグルコース代謝が、良性結節および健康な対照と比較して肺腺癌に共通する変化であることが明らかになった。最後に、LDCT で検出された肺結節の悪性と良性を区別するための高い特異性と感度を備えた血清代謝分類器を確立および検証しました。これは、早期の鑑別診断とリスク評価に役立つ可能性があります。
現在の研究では、性別と年齢が一致した血清サンプルが、174人の健康な対照者、292人の良性肺結節患者、229人のステージI肺腺癌患者から遡及的に収集された。695 人の被験者の人口統計的特徴を補足表 1 に示します。
図 1a に示すように、174 個の健康対照 (HC)、170 個の良性結節 (BN)、および 136 個のステージ I 肺腺癌 (LA) サンプルを含む合計 480 個の血清サンプルが中山大学がんセンターで収集されました。超高性能液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法 (UPLC-HRMS) を使用した非標的メタボローム プロファイリングの発見コホート。補足図 1 に示すように、LA と HC、LA と BN の間の差次的代謝産物が同定され、分類モデルを確立し、示差経路分析をさらに調査しました。中山大学がんセンターが収集した 104 サンプルと他の 2 つの病院が収集した 111 サンプルは、それぞれ内部検証と外部検証の対象となりました。
a 超高性能液体クロマトグラフィー高分解能質量分析法 (UPLC-HRMS) を使用した包括的な血清メタボロミクス分析を受けた発見コホートの研究集団。b 健常対照（HC、n = 174）、良性結節（BN、n = 170）、およびステージIの肺腺癌を含む、研究コホートからの480の血清サンプルの総メタボロームの部分最小二乗判別分析（PLS-DA） (ロサンゼルス、n = 136)。+ESI、正のエレクトロスプレー イオン化モード、-ESI、負のエレクトロスプレー イオン化モード。c–e 2つの所定のグループ（両側Wilcoxon符号付き順位検定、偽発見率調整p値、FDR <0.05）で存在量が大きく異なる代謝物は、赤（変化倍数> 1.2）と青（変化倍数<0.83）で表示されます。 。) 火山のグラフィックに表示されます。f LA と BN の間で注釈付き代謝物の数に大きな違いがあることを示す階層的クラスタリング ヒート マップ。ソース データは、ソース データ ファイルの形式で提供されます。
UPLC-HRMS 分析を使用して、発見グループの 174 HC、170 BN、および 136 LA の総血清メタボロームを分析しました。まず、品質管理 (QC) サンプルが教師なし主成分分析 (PCA) モデルの中心に密集していることを示し、現在の研究のパフォーマンスの安定性を確認します (補足図 2)。
図 1b の部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) に示されているように、正 (+ESI) および負 (-ESI) エレクトロスプレー イオン化モードでは、LA と BN、LA と HC の間に明らかな違いがあることがわかりました。 。孤立した。ただし、+ESI 条件と -ESI 条件では、BN と HC の間に有意差は見つかりませんでした。
LA と HC の間で 382 個の差分特徴、LA と BN の間で 231 個の差分特徴、BN と HC の間で 95 個の差分特徴が見つかりました (Wilcoxon 符号付き順位検定、FDR < 0.05 および多重変化 > 1.2 または < 0.83) (図 .1c-e) ）。。ピークには、m/z 値、保持時間、および断片化質量スペクトル検索 (詳細は方法セクションで説明) 22 によって、データベース (mzCloud/HMDB/Chemspider ライブラリ) に対してさらに注釈が付けられました (補足データ 3)。最後に、LA 対 BN (図 1f および補足表 2) および LA 対 HC (補足図 3 および補足表 2) について、存在量に有意な差がある 33 個と 38 個の注釈付き代謝物がそれぞれ特定されました。対照的に、BN と HC では、存在量に有意な差がある代謝物は 3 つだけ特定されました (補足表 2)。これは、PLS-DA における BN と HC の重複と一致します。これらの差次的代謝産物は、広範囲の生化学物質をカバーしています (補足図 4)。総合すると、これらの結果は、良性肺結節や健康な被験者と比較して、早期肺癌の悪性化を反映する血清メタボロームの有意な変化を示しています。一方、BN と HC の血清メタボロームの類似性は、良性肺結節が健康な人と多くの生物学的特徴を共有している可能性を示唆しています。上皮成長因子受容体 (EGFR) 遺伝子変異が肺腺癌サブタイプ 23 で一般的であることを考慮して、ドライバー変異が血清メタボロームに及ぼす影響を判定しようとしました。次に、肺腺癌グループにおける EGFR 状態の 72 例の全体的なメタボローム プロファイルを分析しました。興味深いことに、PCA分析では、EGFR変異患者（n = 41）とEGFR野生型患者（n = 31）の間に同等のプロファイルが見つかりました（補足図5a）。ただし、野生型 EGFR 患者と比較して EGFR 変異患者ではその存在量が大幅に変化した 7 つの代謝物を特定しました（t 検定、p < 0.05、倍率変化 > 1.2 または < 0.83）（補足図 5b）。これらの代謝産物の大部分 (7 個中 5 個) はアシルカルニチンであり、脂肪酸酸化経路で重要な役割を果たします。
図 2a のワークフローに示すように、結節分類のバイオマーカーは、最小絶対収縮演算子と、LA (n = 136) および BN (n = 170) で同定された 33 個の示差代謝物に基づく選択を使用して取得されました。変数の最適な組み合わせ (LASSO) – バイナリ ロジスティック回帰モデル。モデルの信頼性をテストするために 10 倍の相互検証が使用されました。変数の選択とパラメーターの正則化は、パラメーター λ24 による尤度最大化ペナルティによって調整されます。さらに、内部検証 (n = 104) グループと外部検証 (n = 111) グループでグローバル メタボロミクス分析を独立して実行し、判別モデルの分類パフォーマンスをテストしました。その結果、発見セット内の27の代謝産物が、最大の平均AUC値を持つ最良の判別モデルとして同定されました（図2b）。そのうち9つはBNと比較してLAで活性が増加し、18は活性が減少しました（図2c）。
肺結節分類器を構築するためのワークフロー。これには、10 分割交差検証によるバイナリ ロジスティック回帰モデルを使用した発見セット内の血清代謝物の最適なパネルの選択と、内部および外部検証セットでの予測パフォーマンスの評価が含まれます。b 代謝バイオマーカー選択のための LASSO 回帰モデルの相互検証統計。上記の数字は、特定の λ で選択されたバイオマーカーの平均数を表します。赤い点線は、対応するラムダでの平均 AUC 値を表します。灰色のエラーバーは、AUC の最小値と最大値を表します。点線は、選択された 27 個のバイオマーカーを含む最良のモデルを示します。AUC、受信者動作特性 (ROC) 曲線の下の面積。c 発見グループのBNグループと比較した、LAグループの27の選択された代謝物の変化倍数。赤い列 – アクティベーション。青い列は減少です。d – f 発見、内部、外部検証セット内の 27 の代謝物の組み合わせに基づく判別モデルの検出力を示す受信者動作特性 (ROC) 曲線。ソース データは、ソース データ ファイルの形式で提供されます。
これら 27 の代謝物の加重回帰係数に基づいて予測モデルが作成されました (補足表 3)。これら 27 の代謝物に基づく ROC 分析により、曲線下面積 (AUC) 値は 0.933、発見グループ感度は 0.868、特異度は 0.859 でした (図 2d)。一方、LAとHCの間の注釈付きの38個の示差代謝物のうち、16個の代謝産物のセットは、LAとHCを区別する際に、感度0.801、特異度0.856でAUC 0.902を達成しました（補足図6a〜c）。示差的代謝産物の異なる倍率変化閾値に基づく AUC 値も比較されました。分類モデルは、倍率変化レベルが 1.2 対 1.5 または 2.0 に設定された場合に、LA と BN (HC) の区別に最もよく機能することがわかりました (補足図 7a、b)。27 の代謝物グループに基づく分類モデルは、内部および外部コホートでさらに検証されました。AUCは、内部検証では0.915（感度0.867、特異度0.811）、外部検証では0.945（感度0.810、特異度0.979）でした（図2e、f）。研究室間の効率を評価するために、「方法」セクションで説明したように、外部コホートからの 40 サンプルを外部研究室で分析しました。分類精度は 0.925 の AUC を達成しました (補足図 8)。肺扁平上皮癌 (LUSC) は、肺腺癌 (LUAD) に次いで 2 番目に多い非小細胞肺癌 (NSCLC) のサブタイプであるため、代謝プロファイルの潜在的な有用性の検証もテストしました。BN および LUSC の 16 件。LUSC と BN の間の識別の AUC は 0.776 であり (補足図 9)、LUAD と BN の間の識別と比較して能力が低いことを示しています。
研究によると、CT画像上の結節のサイズは悪性腫瘍の可能性と正の相関があり、依然として結節治療の主要な決定要因であることが示されています25、26、27。NELSON スクリーニング研究の大規模コホートからのデータの分析では、5 mm 未満の結節を有する被験者の悪性腫瘍のリスクは、結節を持たない被験者の悪性腫瘍リスクと同等であることが示されました 28 。したがって、定期的な CT モニタリングが必要な最小サイズは、英国胸部学会 (BTS) の推奨では 5 mm、フライシュナー協会の推奨では 6 mm です 29 。しかし、不確定肺結節（IPN）と呼ばれる、6 mm より大きく、明らかな良性の特徴のない結節は、臨床現場での評価と管理において依然として大きな課題となっています 30,31。次に、発見コホートおよび内部検証コホートからのプールされたサンプルを使用して、結節のサイズがメタボロミクスサインに影響を与えるかどうかを調べました。27 の検証済みバイオマーカーに焦点を当て、まず HC と BN のサブ 6 mm メタボロームの PCA プロファイルを比較しました。HCとBNのデータポイントのほとんどが重複していることがわかり、血清代謝産物レベルが両グループで同様であることが実証されました（図3a）。異なるサイズ範囲にわたる特徴マップはBNとLAでは保存されたままでしたが（図3b、c）、6〜20 mmの範囲では悪性結節と良性結節の間に分離が観察されました（図3d）。このコホートは、6〜20 mmの結節の悪性度を予測するためのAUC 0.927、特異度0.868、感度0.820を有しました（図3e、f）。我々の結果は、この分類器が結節のサイズに関係なく、初期の悪性形質転換によって引き起こされる代謝変化を捕捉できることを示しています。
ad 27 の代謝物の代謝分類子に基づく、指定されたグループ間の PCA プロファイルの比較。CC および BN < 6 mm。b BN < 6 mm 対 BN 6 ～ 20 mm。LA 6 ～ 20 mm と LA 20 ～ 30 mm の違い。g BN 6 ～ 20 mm、LA 6 ～ 20 mm。GC、n = 174;BN < 6 mm、n = 153;BN 6 ～ 20 mm、n = 91;LA 6 ～ 20 mm、n = 89;LA 20 ～ 30 mm、n = 77。 e 受信者動作特性 (ROC) 曲線は、結節 6 ～ 20 mm の判別モデルのパフォーマンスを示します。f 確率値は、6〜20 mmの結節のロジスティック回帰モデルに基づいて計算されました。灰色の点線は、最適なカットオフ値 (0.455) を表します。上の数字は、ロサンゼルスで予測される感染者数の割合を表しています。両側スチューデント t 検定を使用します。PCA、主成分分析。曲線下の AUC 領域。ソース データは、ソース データ ファイルの形式で提供されます。
提案された悪性腫瘍予測モデルの性能を示すために、同様の肺結節サイズ（7 ～ 9 mm）を持つ 4 つのサンプル（年齢 44 ～ 61 歳）がさらに選択されました（図 4a、b）。最初のスクリーニングでは、症例 1 は良性と関連する特徴である石灰化を伴う充実性結節として現れましたが、症例 2 は明らかな良性の特徴を持たない不定の部分的に充実した結節として現れました。3回の追跡CTスキャンにより、これらの症例は4年間にわたって安定していることが示されたため、良性結節と考えられました（図4a）。連続 CT スキャンの臨床評価と比較して、現在の分類モデルを使用したシングルショット血清代謝物分析は、確率的制約に基づいてこれらの良性結節を迅速かつ正確に識別しました (表 1)。症例 3 の図 4b は、胸膜陥没の兆候を伴う結節を示しています。これは悪性腫瘍に関連することが最も多いです 32。症例 4 は、良性の原因の証拠がない、不定の部分的に充実した結節として現れました。これらの症例はすべて、分類子モデルによれば悪性であると予測されました (表 1)。肺腺癌の評価は、肺切除手術後の組織病理学的検査によって実証されました（図4b）。外部検証セットの場合、代謝分類器は 6 mm を超える不定の肺結節の 2 つのケースを正確に予測しました (補足図 10)。
良性結節の 2 例の肺の軸方向の窓の CT 画像。症例 1 では、4 年後の CT スキャンにより、右下葉に石灰化を伴う 7 mm の安定した固形結節が示されました。症例 2 では、5 年後の CT スキャンにより、右上葉に直径 7 mm の安定した部分的に充実した結節が明らかになりました。b 肺切除前のステージ I 腺癌 2 例の肺の軸方向ウィンドウ CT 画像および対応する病理学的研究。症例 3 では、右上葉に直径 8 mm の結節が認められ、胸膜陥没が認められました。症例 4 では、左上葉に 9 mm の部分的に固形のすりガラス状の小結節が認められました。肺腺癌の腺房増殖パターンを示す、切除肺組織のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色 (スケール バー = 50 μm)。矢印は、CT 画像で検出された結節を示します。H&E 画像は、病理学者が検査した複数 (3 つ以上) の顕微鏡領域の代表的な画像です。
まとめると、我々の結果は、肺結節の鑑別診断における血清代謝産物バイオマーカーの潜在的な価値を示しており、CTスクリーニングを評価する際に課題を引き起こす可能性があります。
検証された差次的代謝産物パネルに基づいて、主要な代謝変化の生物学的相関関係を特定しようとしました。MetaboAnalyst による KEGG 経路濃縮分析により、指定された 2 つのグループ間で 6 つの共通の有意に変化した経路が特定されました (LA 対 HC および LA 対 BN、調整済み p ≤ 0.001、効果 > 0.01)。これらの変化は、ピルビン酸代謝、トリプトファン代謝、ナイアシンおよびニコチンアミド代謝、解糖、TCAサイクル、およびプリン代謝の障害によって特徴付けられました（図5a）。次に、絶対定量化を使用して主要な変化を検証するために、ターゲットを絞ったメタボロミクスをさらに実行しました。本物の代謝物標準を使用したトリプル四重極質量分析 (QQQ) による、一般的に変化する経路における一般的な代謝物の測定。メタボロミクス研究の対象サンプルの人口統計学的特徴は、補足表4に含まれています。 私たちの全体的なメタボロミクス結果と一致して、定量分析により、ヒポキサンチンとキサンチン、ピルビン酸、乳酸塩がBNおよびHCと比較してLAで増加していることが確認されました（図5b、c、図5b、c、 p<0.05）。ただし、BN と HC の間では、これらの代謝産物に有意な差は見つかりませんでした。
BN および HC グループと比較した LA グループにおける有意に異なる代謝産物の KEGG 経路濃縮分析。両側グローバルテストを使用し、Holm-Bonferroni 法を使用して p 値を調整しました (調整された p ≤ 0.001 および効果サイズ > 0.01)。b〜d LC-MS / MSによって測定された血清HC、BN、およびLA中のヒポキサンチン、キサンチン、乳酸塩、ピルビン酸塩、およびトリプトファンレベルを示すバイオリンプロット（グループあたりn = 70）。白と黒の点線はそれぞれ中央値と四分位を示します。e LUAD-TCGAデータセットの正常な肺組織（n = 59）と比較した肺腺癌（n = 513）におけるSLC7A5およびQPRTの正規化されたLog2TPM（100万あたりの転写物）mRNA発現を示すバイオリンプロット。白いボックスは四分位範囲を表し、中央の黒い水平線は中央値を表し、ボックスから伸びる垂直の黒い線は 95% 信頼区間 (CI) を表します。f TCGA データセットの肺腺癌 (n = 513) および正常肺組織 (n = 59) における SLC7A5 および GAPDH 発現のピアソン相関プロット。灰色の領域は 95% CI を表します。r、ピアソン相関係数。g LC-MS/MS によって測定された、非特異的 shRNA コントロール (NC) および shSLC7A5 (Sh1、Sh2) をトランスフェクトした A549 細胞の正規化された細胞トリプトファン レベル。各グループの 5 つの生物学的に独立したサンプルの統計分析が表示されます。h A549 細胞 (NC) および SLC7A5 ノックダウン A549 細胞 (Sh1、Sh2) における NADt の細胞レベル (NAD+ および NADH を含む総 NAD)。各グループの 3 つの生物学的に独立したサンプルの統計分析が表示されます。i SLC7A5 ノックダウン前後の A549 細胞の解糖活性を細胞外酸性化率 (ECAR) によって測定しました (グループあたり n = 4 生物学的に独立したサンプル)。2-DG、2-デオキシ-D-グルコース。(b – h) では両側スチューデント t 検定が使用されました。（g – i）では、エラーバーは平均±SDを表し、各実験は独立して3回実行され、結果は同様でした。ソース データは、ソース データ ファイルの形式で提供されます。
LA グループにおけるトリプトファン代謝の変化の重大な影響を考慮して、QQQ を使用して HC、BN、LA グループの血清トリプトファン レベルも評価しました。LAでは血清トリプトファンがHCまたはBNと比較して減少していることがわかりました（p < 0.001、図5d）。これは、肺がん患者の循環トリプトファンレベルが対照群の健康な対照よりも低いという以前の知見と一致しています33,34。 、35。PET/CT トレーサー 11C-メチル-L-トリプトファンを使用した別の研究では、肺がん組織におけるトリプトファンシグナルの保持時間が、良性病変や正常組織と比較して大幅に増加していることがわかりました 36。我々は、LA血清中のトリプトファンの減少は、肺がん細胞による活発なトリプトファンの取り込みを反映しているのではないかと仮説を立てています。
トリプトファン異化のキヌレニン経路の最終生成物は NAD+37,38 であることも知られており、これは解糖におけるグリセルアルデヒド-3-リン酸と 1,3-ビスホスホグリセリン酸の反応の重要な基質である 39。これまでの研究は免疫調節におけるトリプトファン異化の役割に焦点を当ててきたが、我々は今回の研究で観察されたトリプトファン調節不全と解糖経路との相互作用を解明しようと努めた。溶質輸送体ファミリー 7 メンバー 5 (SLC7A5) は、トリプトファン輸送体であることが知られています 43,44,45。キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ (QPRT) は、キノリン酸を NAMN46 に変換するキヌレニン経路の下流に位置する酵素です。LUAD TCGAデータセットの検査により、SLC7A5とQPRTの両方が正常組織と比較して腫瘍組織で有意に上方制御されていることが明らかになりました（図5e）。この増加は、肺腺癌のステージ I および II、ならびにステージ III および IV で観察され (補足図 11)、腫瘍形成に関連するトリプトファン代謝の初期障害を示しています。
さらに、LUAD-TCGAデータセットは、がん患者サンプルにおけるSLC7A5とGAPDH mRNA発現の間に正の相関関係を示しました（r = 0.45、p = 1.55E-26、図5f）。対照的に、正常な肺組織におけるそのような遺伝子サイン間には有意な相関は見つかりませんでした（r = 0.25、p = 0.06、図5f）。A549細胞におけるSLC7A5（補足図12）のノックダウンは、細胞のトリプトファンおよびNAD（H）レベルを大幅に低下させ（図5g、h）、その結果、細胞外酸性化速度（ECAR）によって測定される解糖活性が減弱しました（図1）。5i）。したがって、血清中の代謝変化と in vitro 検出に基づいて、トリプトファン代謝はキヌレニン経路を通じて NAD+ を生成し、肺がんにおける解糖の促進に重要な役割を果たしている可能性があると仮説を立てています。
研究によると、LDCT によって多数の不確定な肺結節が検出されると、PET-CT、肺生検などの追加検査が必要になったり、悪性腫瘍の偽陽性診断による過剰治療が必要になったりする可能性があることが示されています 31。私たちの研究は、CTで検出された肺結節のリスク層別化とその後の管理を改善する可能性がある潜在的な診断価値を持つ血清代謝産物のパネルを特定しました。
肺結節は、良性または悪性の原因を示唆する画像特徴を備えた低線量コンピュータ断層撮影 (LDCT) を使用して評価されます。結節の結果が不確実であるため、頻繁な経過観察、不必要な介入、過剰治療につながる可能性があります。診断価値のある血清代謝分類子を含めることで、肺結節のリスク評価とその後の管理が改善される可能性があります。PET陽電子放出断層撮影装置。
米国の NLST 研究と欧州の NELSON 研究のデータは、低線量コンピュータ断層撮影 (LDCT) による高リスク群のスクリーニングが肺がん死亡率を低下させる可能性があることを示唆しています 1,3。しかし、LDCT によって検出された多数の偶発的肺結節のリスク評価とその後の臨床管理は依然として最も困難です。主な目標は、信頼できるバイオマーカーを組み込むことによって、既存の LDCT ベースのプロトコルの正しい分類を最適化することです。
血液代謝産物などの特定の分子バイオマーカーは、肺がんと健康な対照を比較することによって同定されています 15,17。現在の研究では、LDCT によって偶発的に検出された肺結節の良性と悪性を区別するための血清メタボロミクス分析の適用に焦点を当てました。UPLC-HRMS 分析を使用して、健康対照 (HC)、良性肺結節 (BN)、およびステージ I 肺腺癌 (LA) サンプルの全体的な血清メタボロームを比較しました。HC と BN は同様の代謝プロファイルを持っているのに対し、LA は HC と BN に比べて顕著な変化を示したことがわかりました。我々は、LAをHCおよびBNと区別する2セットの血清代謝産物を同定した。
現在の LDCT ベースの良性結節と悪性結節の識別スキームは、主に結節のサイズ、密度、形態、および経時的な成長速度に基づいています 30。これまでの研究では、小結節のサイズが肺がんの可能性と密接に関係していることが示されています。高リスクの患者であっても、6 mm 未満の結節における悪性腫瘍のリスクは 1% 未満です。6 ～ 20 mm の結節の悪性リスクは 8% ～ 64% の範囲です30。したがって、フライシュナー協会は、定期的な CT フォローアップには 6 mm のカットオフ直径を推奨しています。しかし、6 mm を超える不定形肺結節 (IPN) のリスク評価と管理は適切に行われていません 31。現在の先天性心疾患の管理は、通常、頻繁な CT モニタリングによる経過観察に基づいています。
検証されたメタボロームに基づいて、我々は、健康な個人と 6 mm 未満の良性結節との間のメタボローム シグネチャの重複を初めて実証しました。この生物学的類似性は、6 mm 未満の結節の悪性腫瘍のリスクが結節のない被験者と同じくらい低いという以前の CT 所見と一致しています 30。 我々の結果は、6 mm 未満および 6 mm 以上の良性結節の悪性腫瘍のリスクが高いことも示していることに留意すべきです。メタボロームプロファイルの類似性は、良性病因の機能的定義が結節のサイズに関係なく一貫していることを示唆しています。したがって、最新の診断用血清代謝物パネルは、CT で結節が最初に検出された場合に除外検査として単一のアッセイを提供し、連続モニタリングを削減する可能性があります。同時に、代謝バイオマーカーの同じパネルは、サイズが 6 mm 以上の悪性結節を良性結節から区別し、同様のサイズの IPN と CT 画像上のあいまいな形態学的特徴を正確に予測しました。この血清代謝分類器は、AUC 0.927 で 6 mm 以上の結節の悪性度を予測するのに優れた性能を発揮しました。まとめると、我々の結果は、独特の血清メタボロームサインが初期の腫瘍誘発性代謝変化を特異的に反映しており、結節サイズとは無関係にリスク予測因子として潜在的な価値がある可能性があることを示している。
特に、肺腺癌 (LUAD) と扁平上皮癌 (LUSC) は、非小細胞肺癌 (NSCLC) の主要な種類です。LUSC はタバコの使用と強く関連しており 47、LUAD は CT スクリーニングで検出される偶発性肺結節の最も一般的な組織型である 48 ことを考慮すると、私たちの分類モデルは特にステージ I の腺癌サンプル用に構築されました。Wangらはまた、LUADに焦点を当て、初期段階の肺がんと健康な人を区別するためにリピドミクスを使用して9つの脂質サインを特定した17。現在の分類子モデルをステージ I LUSC の 16 例と 74 個の良性結節でテストしたところ、LUSC の予測精度が低い (AUC 0.776) ことが観察され、LUAD と LUSC が独自のメタボローム シグネチャーを持っている可能性があることが示唆されました。実際、LUAD と LUSC は、病因、生物学的起源、遺伝的異常において異なることが示されています 49。したがって、スクリーニング プログラムにおける集団ベースの肺がん検出のためのトレーニング モデルには、他のタイプの組織学も含める必要があります。
ここでは、健康な対照および良性結節と比較して、肺腺癌で最も頻繁に変化する 6 つの経路を特定しました。キサンチンとヒポキサンチンは、プリン代謝経路の一般的な代謝産物です。我々の結果と一致して、プリン代謝に関連する中間体は、健康な対照または浸潤前段階の患者と比較して、肺腺癌患者の血清または組織中で有意に増加していた15,50。血清キサンチンおよびヒポキサンチンレベルの上昇は、急速に増殖するがん細胞に必要な同化作用を反映している可能性があります。グルコース代謝の調節不全は、がん代謝のよく知られた特徴です51。ここで、HCおよびBNグループと比較して、LAグループでピルビン酸と乳酸の有意な増加が観察されました。これは、非小細胞肺がん（NSCLC）患者の血清メタボロームプロファイルにおける解糖経路異常に関する以前の報告と一致しています。健全なコントロール。結果は一貫しています52,53。
重要なことは、肺腺癌の血清中のピルビン酸とトリプトファンの代謝の間に逆相関があることを観察したことです。血清トリプトファンレベルは、HC または BN グループと比較して LA グループで減少しました。興味深いことに、前向きコホートを使用した以前の大規模研究では、循環トリプトファンレベルの低下が肺がんのリスク増加と関連していることが判明しました 54 。トリプトファンは必須アミノ酸であり、私たちは完全に食物から摂取しています。我々は、肺腺癌における血清トリプトファンの減少は、この代謝産物の急速な減少を反映している可能性があると結論付けています。キヌレニン経路を介したトリプトファン異化の最終生成物が、新たな NAD+ 合成の源であることはよく知られています。NAD+ は主にサルベージ経路を通じて生成されるため、健康および病気におけるトリプトファン代謝における NAD+ の重要性はまだ解明されていません 46。TCGAデータベースの解析により、トリプトファン輸送体である溶質輸送体7A5（SLC7A5）の発現が正常対照と比較して肺腺がんにおいて有意に増加しており、解糖酵素GAPDHの発現と正の相関があることが示された。これまでの研究は主に、抗腫瘍免疫応答の抑制におけるトリプトファン異化作用の役割に焦点を当ててきました40、41、42。今回我々は、肺がん細胞におけるSLC7A5のノックダウンによるトリプトファン取り込みの阻害が、その後の細胞NADレベルの低下と、それに付随する解糖活性の減弱をもたらすことを実証する。要約すると、我々の研究は、肺腺癌の悪性化に関連する血清代謝の変化の生物学的基礎を提供するものである。
EGFR 変異は、NSCLC 患者において最も一般的なドライバー変異です。私たちの研究では、アシルカルニチン患者の一部の EGFR 変異患者では血清レベルが低下していることが判明しましたが、EGFR 変異を持つ患者 (n = 41) は野生型 EGFR を持つ患者 (n = 31) と同様の全体的なメタボロームプロファイルを有することがわかりました。アシルカルニチンの確立された機能は、アシル基を細胞質からミトコンドリアマトリックスに輸送し、脂肪酸を酸化してエネルギーを生成することです 55 。我々の発見と一致して、最近の研究でも、102 個の肺腺癌組織サンプルの全体的なメタボロームを分析することにより、EGFR 変異型腫瘍と EGFR 野生型腫瘍の間で同様のメタボローム プロファイルが同定されました 50。興味深いことに、EGFR変異体グループにもアシルカルニチン含有量が見られました。したがって、アシルカルニチンレベルの変化がEGFR誘発性の代謝変化とその根底にある分子経路を反映しているかどうかは、さらなる研究に値する可能性がある。
結論として、私たちの研究は、肺結節の鑑別診断のための血清代謝分類子を確立し、リスク評価を最適化し、CTスキャンスクリーニングに基づいた臨床管理を促進できるワークフローを提案します。
この研究は、中山大学癌病院の倫理委員会、中山大学第一付属病院、および鄭州大学癌病院の倫理委員会によって承認された。発見グループと内部検証グループでは、中山大学がんセンターがん制御予防部門で毎年健康診断を受けている個人と166個の良性結節から、健康な人から174個の血清と良性結節から244個の血清を採取した。血清。ステージ I の肺腺癌は中山大学癌センターから収集されました。外部検証コホートには、良性結節の症例が 48 件、中山大学第一付属病院からのステージ I の肺腺癌が 39 件、鄭州がん病院からのステージ I の肺腺癌が 24 件ありました。中山大学がんセンターはまた、確立された代謝分類器の診断能力をテストするために、ステージ I の扁平上皮肺がんの 16 例を収集しました (患者の特徴は補足表 5 に示されています)。発見コホートと内部検証コホートからのサンプルは、2018 年 1 月から 2020 年 5 月の間に収集されました。外部検証コホートのサンプルは、2021 年 8 月から 2022 年 10 月の間に収集されました。性別による偏りを最小限に抑えるために、ほぼ同数の男性と女性の症例がそれぞれに割り当てられました。コホート。発見チームと内部レビューチーム。参加者の性別は自己申告に基づいて決定されました。すべての参加者からインフォームドコンセントが得られ、補償は提供されませんでした。良性結節を有する被験者は、術前に収集され組織病理学によって診断された外部検証サンプルからの 1 例を除いて、分析時点で 2 ～ 5 年の時点で安定した CT スキャン スコアを有する被験者でした。慢性気管支炎を除いて。肺腺癌症例は肺切除前に収集され、病理学的診断によって確認されました。空腹時血液サンプルは、抗凝固剤を含まない血清分離チューブに収集されました。血液サンプルを室温で 1 時間凝固させた後、4℃、2851 × g で 10 分間遠心分離して血清上清を収集しました。血清のアリコートを代謝物抽出まで-80℃で凍結した。中山大学がんセンターのがん予防・健康診断部門は、40～55歳の同数の男女を含む100人の健康なドナーから血清のプールを収集した。等量の各ドナーサンプルを混合し、得られたプールを等分して、-80℃で保存した。血清混合物は、品質管理およびデータの標準化のための標準物質として使用されました。
参照血清と試験サンプルを解凍し、複合抽出法 (MTBE/メタノール/水) 56 を使用して代謝産物を抽出しました。簡単に説明すると、50μlの血清を225μlの氷冷メタノールおよび750μlの氷冷メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)と混合した。混合物を撹拌し、氷上で 1 時間インキュベートします。次にサンプルを混合し、内部標準（13C-乳酸塩、13C3-ピルビン酸塩、13C-メチオニン、および13C6-イソロイシン、Cambridge Isotope Laboratoriesから購入）を含む188μlのMSグレード水とボルテックス混合しました。次に、混合物を 15,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、下相を 2 本のチューブ (各 125 μL) に移し、ポジティブおよびネガティブ モードでの LC-MS 分析を行いました。最後に、サンプルを高速真空濃縮器で蒸発乾固させました。
乾燥した代謝産物を 120 μl の 80% アセトニトリルで再構成し、5 分間ボルテックスし、15,000 × g で 10 分間、4°C で遠心分離しました。メタボロミクス研究のために、上清をマイクロインサートを備えた琥珀色のガラスバイアルに移しました。超高性能液体クロマトグラフィー高分解能質量分析 (UPLC-HRMS) プラットフォームでの非ターゲット メタボロミクス分析。代謝物は、Dionex Ultimate 3000 UPLC システムおよび ACQUITY BEH Amide カラム (2.1 × 100 mm、1.7 μm、Waters) を使用して分離されました。陽イオンモードでは、移動相は 95% (A) と 50% アセトニトリル (B) で、それぞれ 10 mmol/L 酢酸アンモニウムと 0.1% ギ酸が含まれています。ネガティブモードでは、移動相 A と B にはそれぞれ 95% と 50% のアセトニトリルが含まれ、両相には 10 mmol/L 酢酸アンモニウム、pH = 9 が含まれていました。グラジエント プログラムは次のとおりでした: 0 ～ 0.5 分、2% B;0.5 ～ 12 分、2 ～ 50% B。12 ～ 14 分、50 ～ 98% B。14 ～ 16 分、98% B;16～16.1。最小、98 –2% B;16.1 ～ 20 分、2% B。オートサンプラー内でカラムを 40℃、サンプルを 10℃に維持しました。流速は０．３ｍｌ／分、注入量は３μｌであった。エレクトロスプレーイオン化 (ESI) 源を備えた Q-Exactive Orbitrap 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) をフルスキャン モードで操作し、ddMS2 モニタリング モードと組み合わせて大量のデータを収集しました。MS パラメーターは次のように設定されました: スプレー電圧 +3.8 kV/- 3.2 kV、キャピラリー温度 320°C、シールド ガス 40 任意温度、補助ガス 10 任意温度、プローブ ヒーター温度 350 °C、スキャン範囲 70 ～ 1050 m/h、解決。データは、Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) を使用して取得されました。
データ品質を評価するために、各サンプルから上清の 10 μL アリコートを除去することによって、プールされた品質管理 (QC) サンプルを生成しました。UPLC-MS システムの安定性を評価するために、分析シーケンスの開始時に 6 回の品質管理サンプル注入を分析しました。その後、品質管理サンプルが定期的にバッチに導入されます。この研究における血清サンプルの 11 バッチすべてが LC-MS によって分析されました。100 人の健康なドナーからの血清プール混合物のアリコートを各バッチの参照物質として使用して、抽出プロセスを監視し、バッチ間の効果を調整しました。発見コホート、内部検証コホート、および外部検証コホートの非標的メタボロミクス分析は、中山大学のメタボロミクス センターで実施されました。広東理工大学分析試験センターの外部研究室も、分類モデルのパフォーマンスをテストするために、外部コホートからの 40 個のサンプルを分析しました。
抽出および再構成後、多重反応モニタリング (MRM) モードのエレクトロスプレー イオン化 (ESI) 源を備えた超高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (Agilent 6495 トリプル四重極) を使用して、血清代謝産物の絶対定量を測定しました。ACQUITY BEH Amide カラム (2.1 × 100 mm、1.7 μm、Waters) を使用して代謝産物を分離しました。移動相は、10 mmol/L 酢酸アンモニウムおよび 0.1% アンモニア溶液を含む 90% (A) および 5% アセトニトリル (B) から構成されていました。グラジエント プログラムは次のとおりです。0 ～ 1.5 分、0% B。1.5 ～ 6.5 分、0 ～ 15% B;6.5 ～ 8 分、15% B。8 ～ 8.5 分、15% ～ 0% B。8.5 ～ 11.5 分、0%B。オートサンプラー内でカラムを 40 °C、サンプルを 10 °C に維持しました。流速は０．３ｍＬ／分であり、注入量は１μＬであった。ＭＳパラメータは次のように設定した：キャピラリー電圧±３．５ｋＶ、ネブライザー圧力３５ｐｓｉ、シースガス流量１２Ｌ／分、シースガス温度３５０℃、乾燥ガス温度２５０℃、および乾燥ガス流量１４Ｌ／分。トリプトファン、ピルビン酸、乳酸、ヒポキサンチンおよびキサンチンの MRM 変換は、205.0 ～ 187.9、87.0 ～ 43.4、89.0 ～ 43.3、135.0 ～ 92.3、および 151.0 ～ 107 でした。それぞれ9個。データは、Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) を使用して収集されました。血清サンプルについては、標準混合溶液の検量線を使用して、トリプトファン、ピルビン酸、乳酸、ヒポキサンチン、およびキサンチンを定量しました。細胞サンプルの場合、トリプトファン含有量は内部標準および細胞タンパク質量に対して正規化されました。
ピーク抽出 (m/z および保持時間 (RT)) は、Compound Discovery 3.1 および TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) を使用して実行されました。バッチ間の潜在的な差異を排除するために、試験サンプルの各特徴的なピークを同じバッチからの参照物質の特徴的なピークで割って、相対存在量を取得しました。標準化前後の内部標準の相対標準偏差を補足表 6 に示します。 2 つのグループ間の差異は、誤検出率 (FDR<0.05、ウィルコクソンの符号順位検定) と倍率変化 (>1.2 または <0.83) によって特徴付けられました。抽出された特徴の生の MS データと参照血清補正 MS データをそれぞれ補足データ 1 と補足データ 2 に示します。ピークのアノテーションは、同定された代謝物、推定でアノテーションが付けられた化合物、推定で特徴付けられた化合物クラス、および未知の化合物を含む 4 つの定義された識別レベルに基づいて実行されました 22 。Compound Discovery 3.1 (mzCloud、HMDB、Chemspider) でのデータベース検索に基づいて、検証済みの標準に一致する MS/MS または mzCloud (スコア > 85) または Chemspider での完全一致アノテーションを持つ生物学的化合物が、示差メタボローム間の中間体として最終的に選択されました。各特徴のピークの注釈は補足データ 3 に含まれています。MetaboAnalyst 5.0 は、合計正規化された代謝産物存在量の一変量解析に使用されました。MetaboAnalyst 5.0 は、大幅に異なる代謝産物に基づいて KEGG 経路濃縮分析も評価しました。主成分分析 (PCA) と部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) は、スタック正規化と自動スケーリングを備えた ropls ソフトウェア パッケージ (v.1.26.4) を使用して分析されました。結節の悪性腫瘍を予測するための最適な代謝物バイオマーカー モデルは、絶対収縮が最小のバイナリ ロジスティック回帰と選択演算子 (LASSO、R パッケージ v.4.1-3) を使用して生成されました。検出および検証セットにおける判別モデルのパフォーマンスは、pROC パッケージ (v.1.18.0.) による ROC 分析に基づいて AUC を推定することによって特徴付けられました。最適な確率カットオフは、モデルの最大ヨーデン指数 (感度 + 特異度 – 1) に基づいて取得されました。値が閾値より小さいサンプルは良性結節、閾値より大きいサンプルは肺腺癌として予測されます。
A549細胞(#CCL-185、American Type Culture Collection)を10% FBSを含むF-12K培地中で増殖させた。SLC7A5 をターゲットとする短いヘアピン RNA (shRNA) 配列と非ターゲット コントロール (NC) をレンチウイルス ベクター pLKO.1-puro に挿入しました。shSLC7A5のアンチセンス配列は以下の通りである:Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3')、Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3')。SLC7A5 (#5347) およびチューブリン (#2148) に対する抗体は Cell Signaling Technology から購入しました。SLC7A5 およびチューブリンに対する抗体は、ウェスタンブロット分析のために 1:1000 の希釈で使用されました。
Seahorse XF 解糖ストレス テストは、細胞外酸性化 (ECAR) レベルを測定します。このアッセイでは、グルコース、オリゴマイシン A、および 2-DG を連続して投与して、ECAR によって測定される細胞の解糖能力を試験しました。
ノンターゲティングコントロール（NC）およびshSLC7A5（Sh1、Sh2）をトランスフェクトしたA549細胞を、直径10cmのディッシュに一晩播種しました。細胞代謝産物を1 mlの氷冷した80%メタノール水溶液で抽出した。メタノール溶液中の細胞を掻き取り、新しいチューブに集め、15,000 × g、4℃で 15 分間遠心分離しました。800 μl の上清を収集し、高速真空濃縮器を使用して乾燥させます。次いで、乾燥した代謝産物ペレットを、上述のようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してトリプトファンレベルについて分析した。A549 細胞 (NC および shSLC7A5) の細胞 NAD(H) レベルは、定量的 NAD+/NADH 比色キット (#K337、BioVision) を製造業者の指示に従って使用して測定しました。代謝産物の量を正規化するために、各サンプルのタンパク質レベルを測定しました。
サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。バイオマーカー発見を目的としたこれまでのメタボロミクス研究 15,18 はサイズ決定のベンチマークとして考慮されており、これらの報告と比較すると、私たちのサンプルは適切でした。研究コホートから除外されたサンプルはありませんでした。血清サンプルは、ターゲットを絞っていないメタボロミクス研究のために発見グループ (306 例、74.6%) と内部検証グループ (104 例、25.4%) にランダムに割り当てられました。また、ターゲットを絞ったメタボロミクス研究の発見セットから各グループから 70 例をランダムに選択しました。研究者らは、LC-MS データの収集および分析中にグループの割り当てを知らされていませんでした。メタボロミクスデータの統計分析と細胞実験については、それぞれの「結果」、「図の凡例」、および「方法」セクションで説明されています。細胞のトリプトファン、NADT、および解糖活性の定量化を独立して 3 回実行し、同一の結果が得られました。
研究デザインの詳細については、この記事に関連する Natural Portfolio レポートの要約を参照してください。
抽出された特徴の生の MS データと参照血清の正規化された MS データをそれぞれ補足データ 1 と補足データ 2 に示します。差分特徴のピーク注釈は補足データ 3 に示されています。LUAD TCGA データセットは https://portal.gdc.cancer.gov/ からダウンロードできます。グラフをプロットするための入力データはソース データで提供されます。この記事にはソースデータが提供されています。
全国肺検診研究会など 低線量CTで肺がん死亡率を減らす。イングランド北部。J.Med.365、395–409 (2011)。
Kramer, BS、Berg, KD、Aberle, DR、Prophet, PC 低線量ヘリカル CT を使用した肺がんスクリーニング: 全国肺スクリーニング研究 (NLST) の結果。J.Med.スクリーン 18、109–111 (2011)。
デ・コーニング、HJ、他ランダム化試験における容積測定CTスクリーニングによる肺がん死亡率の減少。イングランド北部。J.Med.382、503–513 (2020)。
投稿日時: 2023 年 9 月 18 日