クラスター化規則的間隔短回文配列（CRISPR）は、ハイスループットな結果で世界に革命をもたらした第3世代ゲノム編集技術です。様々な生物学的疾患や感染症の治療に用いられてきました。様々な細菌やその他の原核生物（古細菌など）も、ファージから身を守るためにCRISPR/Cas9システムを持っています。CRISPR/Cas9ベースの戦略は、潜在的に変化した耐性遺伝子、転写、およびエピジェネティック制御を標的とすることで、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）の増殖と進行を阻害できることが報告されています。これらの治療介入は、TNBCでも見られる薬剤耐性などの困難な問題に対処するのに役立つ可能性があります。現在、CRISPR/Cas9を標的細胞に送達するために、物理的方法（マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびハイドロダイナミックモード）、ウイルス的方法（アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス）、および非ウイルス的方法（リポソームおよび脂質ナノ粒子）など、様々な方法が用いられています。 TNBCの分子的原因を研究するために様々なモデルが開発されてきたものの、ゲノム編集ツールを生体内に送達するための高感度かつ標的指向的な方法が不足しているため、臨床応用が制限されている。本レビューでは、既存のエビデンスに基づき、TNBCに対するCRISPR/Cas9治療の進歩、課題、限界、そして展望を包括的に検討する。また、人工知能と機械学習の組み合わせが、TNBC治療におけるCRISPR/Cas9戦略をどのように改善できるかについても解説する。
がんは、制御不能な細胞分裂、細胞周期チェックポイントの破壊、および腫瘍抑制遺伝子（TSG）の変異によって特徴付けられます（Matthews et al., 2022）。さまざまな種類のがんの中で、乳がんは女性に最も多いがんの種類であり、世界的に死亡率が高いです（Waks and Winer, 2019）。乳がんは、組織学的および生物学的特徴、臨床症状と挙動、治療への反応など、多様な特徴を持つ不均一な疾患です（Weigelt et al., 2010）。乳がんの分類は、乳がんの診断と腫瘍の予後に関する正確な洞察を提供します。一般的なバイオマーカーと臨床病理学的特徴の使用は、乳がんの分類の主な基準となっています（Tsang and Tse, 2019）。乳がんの予後と治療への反応は、エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2/neu）の存在、組織学的グレード、腫瘍の種類、グレード、サイズ、リンパ節転移など、多数の要因によって影響を受けます（Al-Tubaiti、2020）。乳がんの5つの内在性分子サブタイプが特定されており、ルミナルA、ルミナルB、HER2エンリッチド、基底細胞様、クローディン低発現が含まれます（Prat et al.、2015）。TNBCは、ER、PR、HER2のすべてを発現しないがんの分子サブタイプです（Yin et al.、2020）。これらの病理学的特徴はTNBCに関連しており、他のどのタイプの乳がんよりも急速な進行とより攻撃的な性質が確認されています（Feng et al.、2018）。さらに、Peru ら (2000) はマイクロアレイ技術を使用して乳がんを再分類し、乳がんの 5 つの内在性サブタイプを特定しました (Cadenas、2012)。基底細胞様乳がんは、トリプルネガティブ表現型を持ち、急速な進行と関連する乳がんのサブタイプです。基底細胞様乳がんはすべて TNBC と誤診されることが多いですが、TNBC は 77% にすぎないことに注意する必要があります。対照的に、TNBC の 71～91% は基底細胞様であり、これら 2 種類の乳がんが重複し、異なる分類を表していることを示しています (Wang D.-Y. ら、2019)。このため、予後を明らかにし、現在および将来の治療に対する潜在的な反応を特定するために、TNBC の異質性を特徴付ける必要が生じます。さらに、TNBC はすべての乳がん症例の 15～20% を占め、50 歳未満の女性に多く見られます。 TNBC症例の約20%でBRCA1またはBRCA2変異が報告されている（Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017）。 、2020）。研究によると、TNBCは血管内皮増殖因子、腫瘍関連マクロファージ（TAM）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、および腫瘍の増殖と移動に関与するその他の分子が高レベルで存在する独特の免疫微小環境を有している。したがって、TNBCの微小環境を理解することは、その予後と治療にとって重要である（Fan and He, 2022）。
TNBCの予後を評価し、効果的な治療を確保するためには、主にER、PR、HER2を検出するための免疫組織化学（IHC）と乳房腫瘍を検出するためのマンモグラフィーに基づく正確な診断が重要です。しかし、マンモグラフィーでは壊死や線維化などの腫瘍内の特徴を十分に描写することはできません（Deepak Singh et al., 2021）。予後不良と診断不良により医師が適切な薬剤を処方できないため（Chaudhary, 2020）、TNBC患者のケアを改善するためにさまざまな戦略が用いられています。現在、ドキソルビシンとシクロホスファミドの2つの薬剤がTNBC患者に使用されており、良好な結果を示しています。さらに、カルボプラチンやシスプラチンなどの他のプラチナ製剤も使用されています（Sikov et al., 2015）。さらに、オラパリブ、ベラパリブ、PF-01367338などのPARP阻害剤は、TNBCの治療のための潜在的な化学療法薬として使用されています（Ishino et al., 2018）。Wnt/β-カテニン、NOTCH、およびヘッジホッグシグナル伝達経路はTNBCの発生と進行に関与していることが報告されているため、これらの経路を標的とする薬剤は重要な戦略となる可能性があります（Aysola et al., 2013）。手術、放射線療法、化学療法は今日でもTNBCの治療の主軸ですが、標的療法、免疫療法、Cas9n、dCas9、CRISPR/Cas12、プライム編集、CRISPR/Cas9標的遺伝子治療などのさまざまなCRISPR関連遺伝子編集ツールを含む新しい治療法の開発において大きな進歩が見られています。ここでは、TNBCの治療に使用されるさまざまなCRISPR関連遺伝子編集ツールに焦点を当てます。中でも、CRISPR/Cas9は広く注目を集めている。
Cas9n（Cas9ニッカーゼとも呼ばれる）は、CRISPR/Cas9ゲノム編集システム由来のCas9タンパク質の遺伝子操作された変異体である（Gupta et al., 2019）。Cas9タンパク質は、本来はRuvCとHNHという2つのヌクレアーゼドメインを持ち、その主な機能はDNA二本鎖の切断である。しかし、Cas9nでは、ヌクレアーゼドメインの1つであるHNHが遺伝子変異を起こして不活性化されている。そのため、Cas9nのHNHドメインは機能しない。RuvCドメインのみが活性状態を維持し、Cas9nは一本鎖DNAを切断または切断することができる（Trevino and Zhang, 2014）。Cas9と比較して、Cas9nはオフターゲット効果を効果的に低減し、細胞修復機構を正確に改善することができる。Cas9nは、二本鎖DNAの特定の位置に切断を作成するなど、さまざまな問題を解決するために使用できる。この目的のために、2 つの Cas9n 分子が組み合わされて一緒に使用されました (Yee、2016)。混合系統キナーゼ 3 (MLK3) は、TNBC 転移中の主要な調節因子として機能するマイトジェン活性化プロテインキナーゼです (Cronan et al.、2012)。
MLK3は、TNBC転移につながる複数のシグナル伝達経路を活性化することができます。例えば、c-Jun N末端キナーゼ（JNK）経路は細胞運動性と細胞外マトリックスの分解を制御し、MLK3はJNK経路を活性化することで細胞運動性を高め、浸潤特性を付与します（Rattanasinchai and Gallo、2016）。MLK3はEMTも制御します。そのためには、Snail、Slug、Twistなどの下流の転写因子を活性化します。これらの因子は上皮マーカーの発現を抑制し、間葉系マーカーの発現を促進することで、転移表現型の獲得につながります（Casalino et al.、2023）。MLK3は、ECMリモデリングや、ECMを分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）などのプロテアーゼの活性化に関与していることが観察されています。これにより、腫瘍細胞の浸潤と遠隔部位への転移が促進されます（Katari et al., 2019）。したがって、これまでの研究では、MLK3がTNBCにおいて重要な役割を果たしていることが示されています。RattanasinchaiとGalloは、TNBCモデルを使用してMLK3の役割を研究し、特定のシグナル伝達経路を介して癌の発達を促進することを発見しました。彼らはCRISPR/Cas9nを使用してMLK3を編集し、TNBCの転移が大幅に減少することを観察しました（Rattanasinchai and Gallo, 2016）。
dCas9は、不活性Cas9とも呼ばれ、Cas9タンパク質の改変誘導体です。活性Cas9とは異なり、dCas9はエンドヌクレアーゼ活性を持たないため、DNA二本鎖切断を誘導できません。したがって、dCas9は、DNA配列に変化や修正を加えることなく、ゲノムの特定領域を正確に標的とするために使用できます（Wang et al., 2016）。dCas9では、重要なアミノ酸残基を抑制することで、2つのエンドヌクレアーゼタンパク質であるRuvCとHNHが不活性化されます（Richter et al., 2016）。DNA切断活性がないにもかかわらず、dCas9は遺伝子研究やバイオテクノロジーにおいて多くの重要な役割を果たしています。例えば、ゲノムの特定領域の可視化、転写調節の促進、エピジェネティック修飾の促進などが可能です（Brocken et al., 2018）。
転写因子ZEB1（亜鉛フィンガーEボックス結合ホメオボックス1）は、胚発生、組織修復、および癌の進行中に起こる細胞プロセスである上皮間葉転換（EMT）の媒介において、特異的かつ重要な役割を果たします。EMTは、上皮細胞が間葉細胞に変化する過程であり、その結果、細胞形態、運動性、浸潤性などが変化します（Wu et al., 2020）。ZEB1は、TNBCにおける上皮細胞の細胞間接着と極性の維持に関与するE-カドヘリンやオクルディンなどの複数の上皮マーカーを阻害します（Moreno-Bueno et al., 2008）。さらに、ZEB1はN-カドヘリン、ビメンチン、フィブロネクチンなどの特定のマーカーを活性化し（Konradi et al., 2014）、Rho GTPaseやマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）などの細胞骨格リモデリングに関与する遺伝子も制御します（Huang）。 et al., 2014）。 2022）、さらに、形質転換成長因子-β（TGF-β）、Wntシグナル伝達などのさまざまなシグナル伝達経路にも影響を与え、TNBCにおける腫瘍の浸潤と転移を促進します（Chen et al., 2016）。 数多くの研究と科学的証拠は、ZEB1がTNBCの検出と治療介入のための貴重な薬剤として大きな可能性を秘めていることを示しています。最近の研究では、WaryahらはTNBCモデルを使用し、dCas9によってZEB1の完全な抑制を達成しました。そのため、彼らは生体内条件下でZEB1の非常に高い特異性とほぼ完全な阻害を観察した（Waryah et al., 2023）。
CRISPR/Cas12は、CRISPR/Cpf1と呼ばれる遺伝子編集ツールです。これはCRISPR/Casシステムから派生したもので、Cas12という用語はCRISPR関連タンパク質12（Bharathkumar et al., 2022）を指し、Cas9と完全に類似しています。唯一の違いは、Cas12タンパク質が含まれていることです。Cas9と比較すると、Cas12は遺伝子編集プロセス中に粘着末端を生成するなど、いくつかの独自の機能を持っています。Cas9は平滑末端を生成します（Wang et al., 2021）。Cas12のこの特性は、その特異的なDNA操作技術に貢献しています。標的DNAを正確に認識して切断できるタンパク質として、非常に汎用性が高く、遺伝子編集を含むさまざまな用途に効果的なツールとなっています（Pickar-Oliver and Gersbach, 2019）。
他のCRISPRバリアントと同様に、CRISPR/Cas12もTNBCの遺伝子をノックアウトまたは活性化することができ、病因や治療への反応に重要な役割を果たす遺伝子を標的とする（Yang and Zhang、2023）。このプロセスを実行するために、Cas12を標的遺伝子に誘導するガイドRNA（gRNA）が開発された。Cas12が標的に結合すると、DNAに二本鎖切断を導入し、DNA修復機構を活性化する。修復プロセス中に、誤ったヌクレオチドが組み込まれる可能性があり、遺伝子変異や機能喪失につながる（Zhang et al.、2021a）。さらに、Cas12酵素の改良版（dCas12と呼ばれる）も遺伝子の活性化に使用された。これを転写活性化因子と組み合わせることで、特定の遺伝子を誘導し、活性化することが可能となる。この技術は、腫瘍抑制遺伝子の活性化を促進する上で大きな可能性を秘めている（Sultan et al., 2022）。
プライム編集は、新しく開発された非常に優れたゲノム編集技術です。生物のDNAを非常に正確に改変することができます（Chen and Liu、2023）。プライム編集は、改変されたCRISPR/Cas9酵素と逆転写酵素という2つの主要な構成要素の統合によって実現されます。CRISPR/Cas9酵素の役割は、ゲノム内の特定の部位を選択的に標的とすることであり、逆転写酵素は標的部位のDNAを完全に改変するのに役立ちます（Hassan et al.、2021）。プライマー編集メカニズムでは、最初のステップはプライマー編集ガイドRNA（pegRNA）の作成です（Standage-Beier et al.、2021）。これは、標的DNA内の目的の編集部位に対応する標的配列とRNAテンプレートを含んでいます。次に、pegRNAはプライマー編集ヌクレアーゼ（PE2）とともに標的細胞に導入されます。 PE2は、Cas9酵素、逆転写酵素、プライマー編集アダプターからなる融合タンパク質です（Martín-Alonso et al., 2021）。細胞内では、pegRNAとPE2複合体が、改変したい特定のDNAを探します。Cas9酵素はDNAを切断し、一本鎖からなるテンプレートを作成します（Choi et al., 2022）。逆転写酵素はこのテンプレートを使用して、DNAを編集用に準備します。DNAのコピーに加えて、RNAテンプレートを編集するための指示も含まれます。最後に、新しく作成されたDNA鎖がテンプレートとして使用され、DNAの切断が修復され、目的の改変を含む改変されたDNA配列が生成されます（Ochoa-Sanchez et al., 2021）。プライマー編集メカニズムは、遺伝子に広範囲にわたる変異を引き起こす可能性があります。点変異、挿入、欠失、さらには遺伝子置換を標的にすることができます（Anzalone et al., 2019 ; Chen and Liu, 2023）。プライム編集は、従来のゲノム編集技術に比べていくつかの利点があります。これには、精度の向上、オフターゲット効果の低減、DNA二本鎖切断に頼らずにDNAを編集できる能力などが含まれます（Anzalone et al., 2020）。
CRISPR/Cas9技術は、もともと細菌をプラスミド伝達やファージ感染から保護するために開発され、後にゲノム編集のための効果的なRNAベースのDNAターゲティングツールとして再利用されました（Jiang and Doudna、2017）。さらに、CRISPR/Cas9システムは、細菌ゲノムの50%と古細菌ゲノムの87%に存在することが報告されています（Ishino et al.、2018）。CRISPR/Cas9は、in vivoおよびin vitroモードを使用して、あらゆる異常な遺伝子配列の削除、挿入、および修正のための潜在的なツールです（Sabit et al.、2021）。さらに、CRISPR/Cas9は、目的の標的遺伝子に対する特異性により、適応免疫システムの一部であることが示されています（Chen and Zhang、2018）。
CRISPR/Cas9はCas9と1つのガイドRNA（sgRNA）から構成されます。Cas9は複数のタンパク質成分からなるエンドヌクレアーゼです。さらに、Cas9は認識（REC）とヌクレアーゼ（NUC）の2つのローブから構成され、独自の構造的および立体構造的特性を持っています（Pacesa et al., 2022）。RECローブはさらにREC1、REC2、およびブリッジヘリックスの3つの領域に分かれています（Cromwell et al., 2018）。NUCは、RuvC（RuvC I、RuvC II、RuvC III）、HNH、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）相互作用ドメインの3つのローブから構成されます（図1）（Song et al., 2016）。sgRNAは、CRISPR RNA（crRNA）とトランスコーディング小RNA（トレーサーRNA）の2つの成分から構成されます（図1）。 sgRNAはCas9タンパク質をコネキシンに結合させて活性複合体（エフェクター複合体とも呼ばれる）を形成する（Richter et al., 2012）。crRNAは18～20ヌクレオチドの塩基対で、標的DNA配列の認識に重要な役割を果たす。さらに、crRNAは標的DNAと対合し、tracrRNAはCas9ヌクレアーゼが標的DNAに結合するための足場として機能する（Manghwar et al., 2019）。一方、PAM配列は3ヌクレオチドからなり、エフェクター複合体のDNAへの結合を確認、特定、および媒介する。Cas9タンパク質複合体のサブユニットであるRuvCとHNHは触媒活性を持つ（Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021）。Cas9サブユニットのHNHヌクレアーゼドメインはcrRNAに結合したDNA鎖を切断する。 RuvCヌクレアーゼドメインは他のDNA鎖を切断し、二本鎖切断（DSB）を生成し、その後2つの異なるDNA切断修復メカニズムが活性化されます（Jiang and Doudna、2017）（図1）。
図 1. CRISPR/Cas9 の概要 (A)。CRISPR/Cas9 システムの構成要素: (i) Cas9 エンドヌクレアーゼは標的 DNA 配列を切断する役割を担う。(ii) crRNA と tra-crRNA キメラの融合によって生じるシングルガイド (sg) RNA。(2) Cas9 は、Rec I、Rec II、NUC ローブ (HNH と Ruv C はサブコンポーネント)、PAM 相互作用ドメイン (C) など、対応する機能を持つ複数のコンポーネントを含む。CRISPR/Cas9 タンパク質複合体は、DNA 配列を非相補的および相補的な形態に切断する (D)。CRISPR/Cas9 は、認識、切断、修復の 3 つの段階でゲノムを編集する。設計された sg-RNA は Cas9 を誘導し、相補的コンポーネント crRNA を介して目的の配列を認識する。Cas9 は 5′-NGG-3′ の PAM 配列を認識し、DNA を融解させて DNA-RNA ハイブリッドを形成し、切断を活性化する。 Cas9のHNHドメインは相補鎖を切断し、RuvCドメインは非相補鎖を切断します。CRISPR/Cas9は、非相同末端結合（NHEJ）と相同性指向修復（HDR）という2つの方法で二本鎖DNAを切断して修復します。NHEJは、酵素プロセスによって外来相同DNAが存在しない状態で二本鎖DNAを修復しますが、これはエラーが発生しやすいメカニズムであり、ランダムなDNA配列が挿入または除去される可能性があります。HDRは非常に特異的であり、相同DNAテンプレートを必要とします。
CRISPR/Cas9 を介した修復経路には、非相同末端結合 (NHEJ) と相同性指向修復 (HDR) 機構が含まれます。NHEJ は挿入または欠失を伴うためエラーが発生しやすい経路であり、修復機構中にパターンを必要としません。ランダムなヌクレオチドを使用して標準タンパク質を生成します (Abbasi et al., 2021)。この修復システムは、KU 複合体、クロスコンプリメンティングタンパク質複合体タイプ 4 (XRCC-4)、DNA 末端処理酵素、およびタンパク質キナーゼ DNA-PKcs などの 4 つの複合体で構成されています (Abbasi et al., 2021)。 KU複合体タンパク質は、Ku 70とKu 80の2つのサブユニットを持ち、NHEJ機構において重要な役割を果たします。修復機構は、2つのサブユニット（Ku 70とKu 80）が標的DNAの平滑末端またはほぼ平滑末端に結合することによって開始され（Abbasi et al., 2021）、他のNHEJ関連因子を損傷部位にリクルートするための足場として機能します（Yang et al., 2020）。XRCC-4とDNAリガーゼはそれぞれ334個と911個のアミノ酸から構成され、XRCC4-DNAリガーゼIV複合体はDNA末端の連結を促進します（Chatterjee et al., 2015）。DNA末端処理酵素は、ポリヌクレオチドキナーゼ3'-リン酸としても知られており、DNA末端処理酵素です。DSB修復中にDNAの3'P基を除去し、5'OH基をリン酸化することができます。また、SSB修復経路を用いた一本鎖切断（SSB）の修復も含まれる（Chatterjee et al., 2015）。DNA-PKcsタンパク質キナーゼは、PIKK（ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ関連キナーゼ）およびATM（運動失調性毛細血管拡張症変異）ファミリーの触媒サブユニット、ならびにATMおよびRad3関連ATRから構成されるDNA依存性タンパク質キナーゼである。二本鎖切断（DSB）および一本鎖切断（Yue et al., 2020 ; Peng et al., 2016 ）。
HDRは、相同DNA二重らせんの完全な形で情報がコピーされるため、より正確で適切な修復機構ですが、姉妹染色分体の存在が必要です。これは、哺乳類の細胞周期のS/G2期に起こります。HDRは主に酵母種で起こりますが、NHEJは哺乳類で重要です（Burma et al., 2006 ; Abbasi et al., 2021 ）。完全な修復機構を図1に示します。
TNBCは遺伝的およびエピジェネティックな異常によって引き起こされるため、CRISPR/Cas9を用いた悪性ゲノム/エピゲノム異常の修正は合理的な治療アプローチとなる可能性がある（Chen et al., 2019）。さらに、細胞特異的な転写調節に関与するいくつかの転写因子は、癌細胞特有の特性を示す可能性があり、転写調節が癌治療に優れたアプローチとなる可能性を示唆している（Drost et al., 2017）。遺伝的、エピジェネティック、転写の欠陥など、腫瘍のこれらの分子特性を創薬に利用することで、臨床結果を改善し、スクリーニングコストを削減できる。CRISPRは、癌を引き起こすゲノム標的を検出および特定できるだけでなく、ヒト細胞内の癌遺伝子を編集、抑制、およびエピジェネティックに修飾するためにも使用できる有望な遺伝子編集ツールである（表1）（Ahmed et al., 2021）。腫瘍抑制因子、癌遺伝子、および薬剤耐性に関連する遺伝子を探すために、いくつかのCRISPRスクリーニングが実施されている。図2に、CRISPR/Cas9を用いて様々なTNBC癌遺伝子を編集する方法を示す。
図2. CRISPR/Cas9を用いた様々なTNBC癌遺伝子の遺伝子編集により、腫瘍の増殖と転移が抑制された。これらの癌遺伝子には、TNBCの発生と転移に関与するCDK7、NAT1、UBR5、YTHDF2、ITGA9、CXCR4およびCXCR7、Crypto1、ROR1およびST8SIAが含まれる。
がん細胞の遊走、浸潤、上皮間葉転換（EMT）はITGA9と関連している。これまでの研究では、ITGA9はNotch経路の重要な因子であり、横紋筋肉腫の転移において興味深い役割を果たしていることが示されている（Molistら、2020）。さらに、ITGA9は乳がんを含むいくつかの腫瘍タイプにおいて患者の予後と密接に関連していることがわかっている（Wang Z.ら、2019）。また、ITGA9のバイオインフォマティクス解析では、TNBCにおけるITGA9の発現が他の乳がんサブタイプよりも有意に高いことが示された。ITGA9レベルの上昇は、TNBC患者における腫瘍転移および再発と関連している。 CRISPR/Cas9によるITGA9のノックアウトは、TNBCにおいてβ-カテニン分解を促進することにより、がん幹細胞（CSC）様特性、腫瘍血管新生、腫瘍増殖、転移の減少をもたらした（Wang Z. et al., 2019）。
Crypto-1はTGF-βファミリーの一員であり、初期胚発生、幹細胞の維持、および癌の転移に不可欠です（Ishii et al., 2021）。Tdgf-1としても知られるこのタンパク質は、原始線条、中胚葉、内胚葉の形成の調節、および胚発生中の身体器官の発達における左右非対称性の確立に関与する、発癌性のGPIアンカー型シグナル伝達タンパク質です（Zhang et al., 2021b）。さらに、Cripto-1は幹細胞マーカーとして上皮間葉転換（EMT）に関与することが示されています（Zhang et al., 2021b）。EMTは、胚発生、線維症、創傷治癒などのさまざまなプロセスだけでなく、癌の浸潤と転移にも不可欠です。さらに、Cripto-1は4つのNotch受容体と相互作用し、それらの翻訳後成熟を促進することが示されている（Brandstadter and Maillard、2019）。Notchシグナル伝達経路は、ヒト乳がん細胞の維持に関与することが知られている。研究によると、CRISPR/Cas9によるCrypto-1のノックアウトは、がんの増殖と転移を抑制することが示されている。したがって、Crypto-1はTNBCの重要な治療標的となる可能性がある（Castro et al.、2015）。
XCL12タンパク質とそのケモカイン受容体CXC（CXCR4およびCXCR7）は、がん細胞の増殖、成長、遊走、浸潤において様々な役割を果たします（Wuら、2015）。これらのケモレセプターは、in vivoおよびin vitroモデルの両方において、複数のシグナル伝達経路を介してTNBCの発症と関連付けられています（Wuら、2015）。さらに、CXCR4およびCXCR7の活性化は、TNBCにおける転移感受性の増加および予後不良と関連しています（Karnら、2022）。したがって、CXCR4およびCXCR7のノックアウトは、TNBCを含む乳がんの治療において効果的な薬剤標的遺伝子となる可能性があります。Yangらによる研究Yangら（2019）はCRISPR/Cas9を用いてCXCR4遺伝子とCXCR7遺伝子を同時にノックアウトし、TNBCの増殖、成長、遊走、浸潤が有意に阻害されることを発見した（Yangら、2019）。
TNBC癌遺伝子であるmiR-3662の発現量増加が乳癌組織で観察されている（Yiら、2022）。miR-3662のノックダウンは、in vivoおよびin vitroの両方で乳癌の腫瘍増殖と転移を阻害することが示されている（AgarwalおよびGupta、2021）。HBP-1はWnt/-カテニンシグナル伝達の強力な阻害因子であり、TNBC細胞のmiR-3662を介した増殖に関与していると考えられる。最近、Yiらは、miR-3662-HBP1軸がTNBC細胞におけるWnt/-カテニンシグナル伝達経路を調節することを発見した（Yiら、2022）。腫瘍特異的な発現のため、miR-3662はTNBCの潜在的な治療標的となる可能性がある。したがって、CRISPR/Cas9を用いたmiR-3662のノックダウンは、TNBCの治療のための新しい薬剤を開発する上で優れたアプローチとなる可能性がある。
UBR5は300 kDaのヌクレオリン酸化タンパク質であり、様々な癌における腫瘍形成、転移、および免疫応答の重要な調節因子として同定されている（Shearer et al., 2015 ; Fu et al., 2023 ）。UBR5はTNBCサンプルで高度に上方制御されており、ユビキチンリガーゼ活性を介して増殖を誘導することによりERα機能を刺激することが報告されている（Bolt et al., 2015 ）。原発性TNBCサンプルの全エクソームシーケンス研究でもUBR5の発現増加が示され、TNBCの発症におけるその役割が示唆されている。さらに、CRISPR/Cas9によるUBR5の欠失は、実験マウスモデルにおいてTNBCの転移と増殖を著しく阻害することが示された。さらに、野生型マウスモデルにUBR5を導入するとその機能が完全に回復したが、不活性化変異株ではこの効果は観察されなかった（Liao et al., 2017）。UBR5の欠損は、TNBCにおけるアポトーシス、壊死の増加、および血管新生不良による腫瘍増殖の阻害と関連している。UBR5の喪失により、遠隔臓器への腫瘍転移が減少し、UBR5は主にE-カドヘリン発現を減少させることにより異常なEMTを誘導する（Zhang and Weinberg, 2018）。最近、UBR5はE3ユビキチン化活性を欠くため、TNBCにおけるIFN-γ誘導PDL1転写において非常に重要な因子であることが示された。RNAトランスクリプトーム解析により、UBR5はIFN-γ経路に関連する遺伝子に全身的な影響を与え、プロテインキナーゼRNA（PKR）とそのシグナル伝達因子および活性化因子の活性化レベルを増加させることによりPDL1転写活性化を促進する可能性があることが明らかになった。転写因子1（STAT1）およびインターフェロン調節因子1（IRF1）。しかし、CRISPR/Cas9によるUBR5とPD-L1発現の同時阻害は、どちらか一方の阻害単独よりも相乗的な治療効果があり、腫瘍微小環境に大きな影響を与える（Wuら、2022）。したがって、CRISPR/Cas9はUBR5機能を阻害し、それによってTNBCの転移と腫瘍増殖を抑制するための重要なツールとなる可能性がある。
ROR1は、癌や胚発生中に発現するI型膜貫通タンパク質であり、癌胎児性タンパク質として同定されている（Nicholas Borcherding、2014）。様々なヒト癌の浸潤性挙動は、ROR1の発現亢進と関連している。ROR1を標的とする治療化合物を用いたin vivoおよびin vitro研究から有望な結果が得られている（Chienら、2016）。乳房組織生検におけるROR1 mRNAレベルの上昇は、攻撃的な基底細胞様乳癌（BL）腫瘍およびそれらの身体の他の部位への転移とも関連している。さらに、ROR1の過剰発現は、TNBCの発症の予後マーカーとして同定されている（Chienら、2016）。しかし、CRISPR/Cas9を用いてROR1をサイレンシングし、TNBCの増殖と転移を抑制することは、効果的な戦略となるだろう。
シアル化プロセスは、シアル酸を糖複合体に付加するものであり、シアル酸転移酵素（ST）によって触媒されます。ST8SIA1はSTファミリーに属し、リンパ性白血病や大腸がんなどの様々な疾患の病態形成において重要な役割を果たしています（Chang et al., 2018）。RNA配列解析によると、ST8SIA1はTNBC患者の乳腺組織で高発現しており、腫瘍抑制遺伝子p53の変異と正の相関関係にあることが示されており、TNBCの病態形成に寄与している可能性があります（Battula et al., 2017）。さらに、ST8SIA1はTNBCの転移と再発に関与しており、TNBCの発生と進行において重要な役割を果たしていることが示唆されています。 TNBCのin vitroモデルにおいて、CRISPR/Cas9によるST8SIA1のノックダウンは、増殖と転移を阻害することが示されている（Battulaら、2017）。このことから、CRISPR/Cas9はTNBCの治療においてST8SIA1癌遺伝子の機能を阻害するための重要なツールとなる可能性が示唆される。
NAT1は、第II相異物化合物の形成を触媒する代謝酵素であり、ほぼすべてのヒト組織で発現しています。NAT1は、芳香族アミン基質が存在しない場合でも、補因子である葉酸を使用してアセチルCoA（アセチルCoA）を標的とすることができます（Stepp et al., 2015 ; Laurieri et al., 2014 ）。研究により、NAT1は乳がん細胞モデルにおいてマトリックスメタロプロテイナーゼ9（MMP9）の機能を調節し、グルコース飢餓時の活性酸素種（ROS）から保護することが示されています（Wang et al., 2018 ）。NAT1の欠失はピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を阻害し、ミトコンドリア機能障害を引き起こすことが示されています（Wang L. et al., 2019 ）。さらに、他の様々な報告では、低分子化合物やsiRNAによるサイレンシングを用いたNAT1阻害が乳がん細胞の浸潤性や増殖を減少させることが示されている（Steppら、2018）。最近では、CRISPR/Cas9を用いて乳がん細胞株MDA-MB-231のNAT1を抑制し、その発現レベルに応じて細胞代謝に影響を与えることが示された。この研究でも、NAT-1がTNBCの進行と転移に重要であることが示された（Carlisleら、2020）。
癌遺伝子の協調的な転写は、スーパーエンハンサー、転写因子、および補因子によって制御されています（Hnisz et al., 2015）。さらに、CDK7、CDK8、CDK9、CDK12、CDK13などのサイクリン依存性キナーゼ（CDK）群が転写制御に必要です。その中でも、CDK7はRNAポリメラーゼIIのリン酸化に関与しており、これはTNBCの病因における癌遺伝子転写の開始と拡大に非常に重要です。先駆的な研究では、CRISPR/Cas9によるCDK7の欠失がTNBCを抑制し、TNBCの病因がCDK7に依存していることが示されました（Wang Y. et al., 2015）。
研究によると、MYCとRBP（RNA結合タンパク質）の変異はアポトーシスを引き起こす可能性があるが、MYCまたはRBPの単一遺伝子変異は癌細胞の増殖に影響を与えないことが示されている（Einstein et al., 2021）。CRISPR/Cas9ベースのライブラリーを使用して、ヒトゲノム中の1000以上のRBPがスクリーニングされた。そのうち、57のRBPがMYCレベルが非常に高い癌細胞の増殖に重要であることが判明した（Wheeler et al., 2020）。さらに、YTHDF2はTNBC細胞の増殖を維持するために重要であり、MYC発現が高い癌細胞では高レベルの転写と翻訳中にメチル化転写産物の量を減少させる。さらに、YTHDF2はがん細胞にとって必須ではなく、TNBC患者の生存期間を延長するためにMYCレベルの上昇にあまり依存していない（Einstein et al., 2021）ことから、TNBCを克服できる薬剤の潜在的な治療標的となる可能性がある。
亜鉛フィンガータンパク質（ZNF）は、ヒトゲノム全体の約1%を占めています。研究により、ZNFは肝臓がん、乳がん、大腸がんなど、さまざまな癌における細胞増殖を調節できることが示されています（Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017）。CRISPRノックアウトによって生成されたライブラリーは、乳がん細胞におけるさまざまな腫瘍抑制遺伝子（TSG）のスクリーニングに使用されてきました（Shalem et al., 2014）。それ以来、CRISPR/Cas9 ZNF319欠損乳がん細胞のトランスクリプトーム研究により、ZNF319は乳がんの増殖を抑制する腫瘍抑制遺伝子であり、したがってさまざまな潜在的なシグナル伝達メカニズムやその他の生物学的機能に関与していることが示されています（Wang L. et al., 2022）。
フェロトーシスは、鉄の存在に依存するプログラム細胞死の一種です。フェロトーシスの発生は、脂質過酸化物の存在によって影響を受けることが知られています。さらに、PKCβIIは初期の脂質過酸化を示すことが報告されており、脂質過酸化の増加はフェロトーシスと関連しています。CRISPR/Cas9を介したキナーゼ阻害剤ライブラリーのスクリーニングにより、PKCβIIが脂質過酸化のプロセスに関与しており、これがMDA-MB-231細胞におけるフェロトーシスに重要であることが明らかになりました（Zhang et al., 2022）。したがって、CRISPR/Cas9によるPKCβIIのノックアウトは、フェロトーシス関連疾患の治療における潜在的な腫瘍抑制遺伝子標的となる可能性があることが示唆されます（Zhang et al., 2022）。
薬剤耐性は、がん患者の死亡の約90%の原因であると考えられており、がん治療における主要な課題の1つです（Bukowski et al., 2020）。結果によると、薬剤排出、DNA修復、アポトーシス、およびさまざまな細胞シグナル伝達経路に関連する十分な数の遺伝子が薬剤耐性に関連しています（Haider et al., 2020）。これらの遺伝子のうち、いくつかの遺伝子はCRISPR/Cas9ツールによって標的とされ、薬剤耐性の低減と抗がん治療の有効性の向上において有望な結果を示しています（Vaghari-Tabari et al., 2022）。さらに、ハイスループットCRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトスクリーニングライブラリは、潜在的な薬剤耐性遺伝子標的の機能の変更に関与しています（Shalem et al., 2015）。パクリタキセル耐性遺伝子を特定するために、RNAシーケンスとゲノムワイドsgRNAライブラリースクリーニングを組み合わせて、再発性TNBC患者の薬剤耐性に関連するヒストン脱アセチル化酵素9（HDAC9）を含む8つの候補遺伝子を特定しました（Bら、2020）。別の研究では、抗がん剤で治療されたTNBC患者の生存中に、ジセリン/スレオニンおよびチロシンプロテインキナーゼ（DSTYK）の発現増加が観察されました。さらに、CRISPR/Cas9によるDSTYKのノックダウンは、in vitro（SUM102PT細胞およびMDA-MB-468細胞）およびin vivo TNBCモデルにおける薬剤耐性癌細胞のアポトーシスを著しく増強しました（Ogbuら、2021）。
TNBCではMAPK経路の異常な活性化が見られるものの、MEK標的療法の臨床効果は乏しい。CRISPR/Cas9ゲノムライブラリースクリーニングにより、PSMG2（プロテオームアセンブリシャペロン2）の阻害がTNBC BT549細胞およびMB468細胞をMEK阻害剤AZD6244に感受性にすることが明らかになった。CRISPR/Cas9によるPSMG2のノックダウンは正常なプロテアソーム機能を変化させ、オートファジーを介したPDPK1の分解を引き起こし、AZD6244（MEK阻害剤）およびMG132（プロテアソーム阻害剤）によって誘導されるTNBCマウスモデルにおける腫瘍細胞をさらに改善した。したがって、プロテアソーム阻害剤とMAPキナーゼ（MEK）阻害剤を相乗的に投与することで、腫瘍細胞の増殖を抑制できる可能性がある（Wang X. et al., 2022）。
CRISPR/Cas9は、TNBC耐性につながる遺伝子機能の喪失をスクリーニングするためにも使用されています（Shu et al., 2020）。Geらは、TNBCにおけるBETブロモドメイン阻害剤（BBDI）であるJQ1で処理した癌細胞の薬剤耐性のメカニズムを説明しました。CRISPR/Cas9を使用して、rb1遺伝子の欠失がTNBCを抗癌剤JQ1に対する耐性にすることを引き起こすことを発見しました。したがって、rb1機能はTNBCにおけるJQ1薬剤への反応において重要です。彼らはまた、パクリタキセルがCDK4/6キナーゼ/微小管阻害剤であり、JQ1などのBBDIとの併用が薬剤耐性TNBCに対して有望な治療効果をもたらす可能性があることも報告しました（Ge et al., 2020）。
長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）の転写ランドスケープは、TNBCにおける術前補助療法への抵抗性に関与していることが報告されている。本研究では、5種類の異なるMALAT1 lncRNA転写産物がTNBCで高発現していることが示された。さらに、CRISPR/Cas9によるMALAT1の欠失は、TNBC BT-549細胞のパクリタキセルおよびドキソルビシンに対する感受性を高め、TNBCにおけるMALAT1抵抗性の潜在的な役割を示唆している（Shaathら、2021）。
BRCA1 の変異 (BRCA1m) は不均一であるため、検出が困難です。BRCA1 の合成致死パートナーである PARP1 (ポリ (ADP-リボース) ポリメラーゼ) を標的にすることで、TNBC の薬剤化学感受性を高めることができます。CRISPR/Cas9 を使用すると、PARP1 の欠失により、mBRCA1 変異型 TNBC 細胞に対するドキソルビシン、ゲムシタビン、ドセタキセルなどの抗がん剤の感受性が高まり、PARP1 が TNBC の薬剤耐性にも関与していることが示唆されます (Vaghari-Tabari et al., 2022)。腫瘍抑制遺伝子 BRCA1 または BRCA2 の変異は、ヒトの乳がん発症の可能性を高めることが知られています。これらの患者の治療には、PARP 阻害剤の使用が必要です。さらに、CRISPR/Cas9 を用いてヌクレオチドサルベージ因子 DNPH1 をノックアウトすると、毒性ヌクレオチド 5-ヒドロキシメチルデオキシウリジン (hmdU) 一リン酸が除去され、BRCA 欠損細胞の PARP 阻害剤に対する感受性が向上することが実証されています (Fugger ら、2021)。したがって、CRISPR/Cas9 と PARP1 阻害剤は、TNBC の重要な治療戦略となる可能性があります。
浸透性糖タンパク質（P-gp）遺伝子は多剤耐性遺伝子であり、一般的にTNBCの約41%で発現が亢進している（Sunら、2020）。P-gp誘導性薬剤排出は、乳がんにおける薬剤耐性の重要な調節因子として同定されている。P-gp阻害剤は、乳がんにおける抗がん剤に対する感受性を高めることが示されている（Famtaら、2021）。したがって、CRISPR/Cas9を介したP-gpの除去または抑制、およびP-gp阻害剤は、TNBCにおける薬剤耐性を克服するための非常に重要な方法となる可能性がある。
ATP結合カセットトランスポーターG2（ABCG2）はTNBCの薬剤耐性の原因となることが知られているが（Palasuberniam et al., 2015）、CRISPR/Cas9とABCG2サイレンシングおよび腫瘍抑制遺伝子不活性化の関係については今のところ報告がない。PTENはABCG2の活性化を促進する可能性がある（Palasuberniam et al., 2015）（Deepak Singh et al., 2021）。したがって、CRISPR/Cas9を使用してABCG2を除去し、ABCG2阻害剤と組み合わせることは、TNBCの薬剤耐性を克服するための適切な治療法となる可能性がある。表2には、CRISPR/Cas9がすべての耐性遺伝子を標的としていることが示されている。
表2. CRISPR/Cas9は様々なTNBC耐性遺伝子を標的として、細胞を抗がん剤に感受性にする。
CRISPR/Cas9ライブラリーは、癌の病因に関連する遺伝子変異をスクリーニングするための有望なツールである（Chan et al., 2022）。このスクリーニング方法は、（a）ライブラリーの構築、（b）レンチウイルス形質導入、（c）表現型スクリーニング、および（d）標的遺伝子解析の4つのステップから構成される。TNBCではMAPK経路の異常な活性化が見られるが、PTEN、RB1、TP53などの腫瘍抑制遺伝子に変異を有するTNBC患者に対するMEK標的療法の臨床予後は非常に不良である。
さらに、CRISPR/Cas9 を使用した遺伝子ノックアウト スクリーニングでは、グアテマラの花や葉の抽出物に豊富に含まれる最も強力で選択的な分子であるデヒドロカトロールをテストし、MDA-MB-231 に対するデヒドロカトロールの効果を理解しました。選択的細胞毒性のメカニズム。TNBC サブタイプのメセンキム幹細胞特性。この CRISPR/Cas9 ベースのスクリーニングでは、17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ タイプ 11 をコードする遺伝子 HSD17B11 が MDA-MB-231 細胞で高発現し、MDA-MB-231 細胞に特異的なデヒドロファルカリノールを生成することも明らかになりました (Grant et al., 2020)。したがって、これは、CRISPR/Cas9 ゲノム スクリーニングが、潜在的な天然化合物の抗がん特性の根底にあるメカニズムを特定する上で大きな可能性を秘めていることを示唆しています。
さらに、TNBCの癌に対する脆弱性は、バイアスのないゲノムワイドなin vivo CRISPR/Cas9スクリーニングを用いて研究され、発癌経路と腫瘍抑制経路の関連性が示されました。mTOR経路とHippo経路の主要構成要素は、TNBCの腫瘍制御において重要な役割を果たすことが報告されています。さらに、in vitro薬物マトリックスシナジーモデルとin vivo患者由来異種移植片を用いた研究では、mTORC1/2とYAPオンコプロテインの薬理学的阻害がTNBCの病原性を効果的に阻害することが示されています。さらに、Torin-1を介したmTORC1/2阻害はマクロピノサイトーシスを増強する一方、ベルテポルフィン誘導YAP阻害はTNBC細胞死を引き起こします。これらの結果を総合すると、ゲノムワイドなin vivo CRISPRスクリーニングがTNBCの新規かつ効果的な治療法を特定するための強力かつ堅牢な手段であることが強調されます（Dai et al., 2021）。
免疫系の調節異常は、腫瘍形成における重要な要因です。がん細胞は、腫瘍微小環境における免疫細胞の活動を妨害したり、免疫系を弱体化させたりするなど、防御機構を回避することで免疫による排除を逃れます。したがって、免疫系の改善は、腫瘍と闘うための重要なアプローチとなる可能性があります。CRISPR/Cas9 ベースの遺伝子改変の使用は、さまざまな観点から免疫機能不全に関連するいくつかの問題に対処します。CRISPR/Cas9 は、次の経路を介して乳がんに対する抗腫瘍免疫を改善するために使用されてきました (図 3)。
図 3. CRISPR/Cas9 免疫療法は TNBC 細胞を標的とする。CDK5 の喪失と PDL1 および CD155 のノックダウンは免疫系を強化する。同様に、A2AR の喪失と HER2、ムチン 1、TEM8 などの TAA のノックダウンは、CAR-T 細胞による癌細胞の殺傷効率を高める。CRISPR/Cas9 駆動型 T 細胞スクリーニングにより、p38 キナーゼの破壊が T 細胞の抗腫瘍活性を高めることが示されている。CRISPR/Cas9 によって改変された T 細胞は TCR (T 細胞受容体) の発現を増加させ、その結果、T 細胞は抗腫瘍活性を持つ。
免疫療法の目標は、免疫系を刺激して癌細胞を攻撃することです。免疫チェックポイントタンパク質の過剰発現は通常、自己免疫反応を予防しますが、癌が自己免疫反応を回避するのに役立つ可能性があります（Topalian et al., 2015）。これらのタンパク質は、免疫細胞の表面にある受容体に結合することで免疫反応を予防します。複数のチェックポイントタンパク質（CD155やPD-L1など）は、免疫細胞上のPD-1受容体を標的とし、乳癌、特にTNBCで発現しています（Li Y.-C. et al., 2020）。CRISPR/Cas9を使用してPD-L1またはその受容体をノックダウンすると、免疫系を刺激してTNBC腫瘍を攻撃することができます（Yahata et al., 2019）。さらに、CRISPR/Cas9を介したCDK5の欠失によるPD-L1発現のダウンレギュレーションは、in vitroおよびin vivoで腫瘍の増殖を阻害することが示されています（Deng et al., 2020）。乳がんのin vitroおよびin vivoモデルにおける増殖抑制は、shRNAを介したCD155の減少が乳がんに対して治療効果を持つ可能性を示唆している（Gaoら、2018）。
CAR T細胞は、腫瘍関連抗原（TAA）を認識するCARを発現し、チェックポイントタンパク質のノックダウンを利用して活性を高めることができる（Li C. et al., 2020）。乳がんにおけるCAR T細胞療法の潜在的な標的は多岐にわたり、HER2、mucin1、TEM8などのいくつかのTAAが含まれる（Bajgain et al., 2018）。メソテリン（TNBC BT-459細胞で過剰発現）を標的とするCAR T細胞は、PD-1をCRISPR/Cas9でノックアウトすると、がんに対してより効果的であるという証拠がある（Hu et al., 2019）。しかし、患者からT細胞を分離し、体外で編集することは、労力と時間がかかるプロセスである。普遍的な T 細胞は分離の必要性を減らすことができるが、移植片対宿主異常を防ぐために、ヒト白血球抗原 (HLA) クラス I および T 細胞受容体 (TCR) を発現するドナー T 細胞を除去する必要がある (Ren et al., 2017)。CRISPR/Cas9 を使用すると、HDR は TCR と HLA を同時に除去し、CAR をコードする遺伝子をノックアウトすることができる。研究によると、CRISPR/Cas9 を使用すると、抗 CD19 CAR を TCR 遺伝子座に導入することができ、T 細胞を枯渇させることなく CAR を効率的に生成できることが示されている (Dimitri et al., 2022)。マルチプレックス技術は、TCR、β-2-ミクログロブリン (B2M)、HLA-I サブユニット、および PD-1 や CTLA-4 などの他のタンパク質を同時に除去することにより、同種 CAR T 細胞を生成するために開発されており、より大きな抗がん特性を持つ可能性がある。 TNBC に対して（Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022）。
CRISPR/Cas9 を使用すると、CAR-T 細胞の有効性が向上する可能性があります。アデノシンは免疫抑制特性を持つことが知られており、T 細胞の機能を阻害し、アデノシン A2A 受容体 (A2AR) を活性化することで抗がん免疫を低下させることができます (Vigano et al., 2019)。CRISPR/Cas9 を使用して A2AR をサイレンシングすると、生体内で CAR-T 細胞の有効性が著しく向上しました (Giuffrida et al., 2021)。T 細胞は、細胞増殖、分化、酸化ストレス、ゲノムストレスなど、さまざまな表現型特性を示すことが知られています。CRISPR/Cas9 ベースの T 細胞スクリーニングにより、25 種類の異なる T 細胞受容体キナーゼの破壊が明らかになりました。その中で、p38 キナーゼの欠失は T 細胞の抗腫瘍活性を高めることが示されており、p38 キナーゼが CAR-T 細胞制御の重要な調節因子であることを示しています (Gurusamy et al., 2020)。
T細胞はCRISPR/Cas9を用いて遺伝子改変することで、高発現TCRを産生させることができる。遺伝子改変T細胞を患者に移植すると、内因性T細胞よりも強力な抗がん活性を示すことが示されている。そのため、患者体内では内因性TCRが遺伝子改変TCRと競合し、がん免疫療法の可能性に影響を与える可能性がある。この問題を克服するために、CRISPR/Cas9を用いてレシピエント細胞から内因性TCR-βを除去し、その後TCR-β T細胞をがん患者に移植することで、内因性TCRの性的競合を必要とせずに、より優れた抗がん免疫応答を示す可能性がある（Fanら、2018）。したがって、CRISPR改変T細胞を除いて、TCRは正常なTCR導入T細胞よりも腫瘍抗原に対して1000倍も敏感である。さらに、様々な白血病において、γδ TCR+ CRISPRによって生成された改変T細胞は、標準的なTCR移植よりもCD4+およびCD8+ T細胞の発現が高い（Legutら、2018）。したがって、CRISPR/Cas9によって生成された改変T細胞は、TNBCを克服するための効果的な免疫療法となる可能性がある。
インテグリンは細胞膜に存在する細胞接着分子であり、細胞と細胞外マトリックス（ECM）との結合を促進する（Hamidi and Ivaska、2018）。インテグリンの調節異常は細胞外マトリックスを変化させることで癌の発生と移動に関与し、循環系における癌細胞の生存につながる（Hamidi and Ivaska、2018）。CRISPR/Cas9によるインテグリンのノックダウンは、TNBCにおける腫瘍の進行、転移、および定着を遅らせる。インテグリンα5（ITGA5）のノックダウンは、肺癌などの他の癌における細胞の移動と進行を減少させることが報告されており（Ju et al.、2017）、インテグリンα5がTNBCの病因における重要な因子である可能性も示唆されている。
従来の胚性幹細胞（ES細胞）法を用いてノックアウトマウスを作製することは、労力がかかり、時間も労力も非効率的なプロセスである。相同組換えによってES細胞を標的とし、キメラマウスを繁殖させ、さらにヘテロ接合マウスと交配させてホモ接合の子孫を得るには、数ヶ月から数年かかる。複数の遺伝子変異を持つマウスを作製するには、複雑な交配が必要となる。しかし、CRISPR/Cas9を用いてES細胞をアブレーションしたり、CRISPR/Cas9コンポーネントを単細胞受精卵にマイクロインジェクションしたりして作製したマウスを用いる場合、多くの問題が生じている。例えば、変異の導入はしばしば二対立遺伝子座で起こり、遺伝子特異的ではない。最近、CRISPR/Cas9技術を用いたES細胞では、最大5つの遺伝子に二対立遺伝子変異を同時に導入できることが報告された（Nishizono et al., 2021）。この目的のために、Cas9 mRNAと5つの遺伝子特異的gRNAがES細胞に同時に導入された。これは、この手順の有望性と有効性を強調するものですが、これらの変異は、創始系統を交配して五重ノックアウトマウスを作製した際に受け継がれた可能性があります。この研究では、驚くべき発見も報告されています。遺伝子改変マウスを作成するためにES細胞はもはや必要ありません。代わりに、特定の遺伝子産物を除去するために、Cas9 mRNAとgRNAが単細胞段階の胚に注入されました。その結果、理論的にはマウスにおける遺伝子欠失の影響を研究するために使用できるノックアウト創始系統が作成されました（Qin et al., 2016）。このように、CRISPR/Cas9は、従来の遺伝子工学よりも低コストでTNBCを治療するためのトランスジェニックマウスの作成を可能にします。CRISPR/Casシステムを使用して、TNBCの1つ以上の内因性遺伝子に点変異をうまく導入できる新しいノックアウトマウスモデルが開発されました。この概念に基づき、CRISPR/Cas9によるBRCA1およびp53の欠失を用いてTNBCの動物モデルを開発することも可能であり、その結果、HR修復の喪失、ゲノム不安定性、および変異表現型が生じる（Annunziato et al., 2020）。
現在、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）の診断には、マンモグラフィー、磁気共鳴画像法（MRI）、超音波検査など様々な方法が用いられています。しかし、これらの方法にはいくつかの限界があります。マンモグラフィーは、がん細胞が他の臓器に転移した部位ではなく、局所的な乳房組織の診断に用いられます。超音波検査は、TNBCの診断において信頼できる方法ではありません（Chen and Lee-Felker, 2023）。MRIは超音波検査やマンモグラフィーよりも感度が高いものの、診断精度には限界があります（Sha and Chen, 2022）。組織生検は、がん細胞を特定するための侵襲的な方法です。しかし、針が目的の部位から外れると、がん組織を見逃してしまう可能性があります。さらに、非常に高額で、患者にとって大きな負担となる場合もあります。TNBCは多様ながんであるため、生検だけではがんの種類に関する十分な情報が得られない可能性があります。したがって、TNBCを検出するための、診断的に信頼できる新たな方法が緊急に必要とされています。 CRISPR/Cas9は、乳がん診断のための高感度かつ低侵襲な代替手段となる可能性がある。この目的のために、CRISPR/Cas9ベースの戦略は、TNBCの診断のためのPCR法を改善するために使用できる。まず、CRISPRシステムのCas9およびcpf1タンパク質を使用して非特異的DNAを除去し、次にこれら2つのタンパク質（Cas9およびcpf1）は、標的DNAに結合する前にPAM配列を認識できる（Deepak Singhら、2021）。したがって、PCRはがん発生に関連する変異を特定できる。いくつかの研究では、さまざまな癌におけるさまざまな変異を検出するために、このCRISPRベースの戦略を採用している（Safariら、2019）。したがって、CRISPRベースのPCR法は、生検ベースの免疫組織化学などの侵襲的な方法へのTNBC診断の依存を減らす可能性がある。
TNBCではホルモン受容体調節の遺伝子型変化も確認されている（Chen and Russo, 2009）。ポイントオブケア診断用のマイクロアレイを用いたCRISPR/Cas9ベースのPCR戦略は、これらの変異を効果的にモニタリングできる（Hajian et al., 2019）。また、TNBC患者の特定の変異に関する関連情報を医療従事者に提供し、治療経過の改善に役立てることもできる。しかし、この複合技術には限界がある。そのため、このCRISPR/Cas-PCR法をTNBCの診断に医療現場で使用するには、広範な研究努力が必要である（Yang et al., 2019）。
投稿日時：2024年10月14日